旋毛蟲49ku ES抗原基因核酸疫苗構(gòu)建及免疫保護(hù)作用研究.pdf

1、本研究根據(jù)GenBank中已發(fā)表的序列(M64242)為參考設(shè)計(jì)引物，用SDS裂解液配合蛋白酶K的方法提取總RNA，用RT-PCR方法從黑龍江豬、犬、貓旋毛蟲，美國豬旋毛蟲、旋毛形線蟲、本地毛形線蟲6個(gè)旋毛蟲隔離種的成囊前期幼蟲及黑龍江豬旋毛蟲不同發(fā)育時(shí)期(成囊前期幼蟲、肌幼蟲、成蟲)蟲體中擴(kuò)增出了帶有Kozak序列的49kuES抗原基因，將目的基因定向克隆入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1。構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD18-T-S/EL

2、、pMD18-T-D/EL、pMD18-T-C/EL、pMD18-T-AS/EL、pMD18-T-T1/EL、pMD18-T-T2/EL，pMD18-T-S/ML和pMD18-T-S/AM，經(jīng)PCR、限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI進(jìn)行單、雙酶切鑒定，陽性質(zhì)粒測序。成功克隆了6個(gè)旋毛蟲隔離種成囊前期幼蟲及豬旋毛蟲不同發(fā)育時(shí)期蟲體49kuES抗原基因。序列分析結(jié)果顯示：49kuES抗原基因由起始密碼子到終止密碼子的核苷酸長為951bp，

3、包含完整的閱讀框，編碼316個(gè)氨基酸殘基。 所獲6個(gè)旋毛蟲隔離種基因序列經(jīng)同源性分析表明，6個(gè)旋毛蟲隔離種與GenBank上發(fā)表的序列核苷酸的同源性為97.0％～97.5％，推導(dǎo)氨基酸的同源性為93.4％～94.6％。6個(gè)隔離種之間的同源性為99.3％～99.9％，基因的保守性很強(qiáng)，不同隔離種之間的差異很小，其編碼蛋白的抗原性也基本相同。 所獲豬旋毛蟲不同發(fā)育時(shí)期蟲體基因序列經(jīng)同源性分析表明，豬旋毛蟲成囊前期期幼蟲、肌幼

4、蟲和成蟲與GenBank中已知序列的同源性分別為，97.5％、97.3％和97.3％；豬旋毛蟲不同發(fā)育時(shí)期蟲體之間具有高度同源性，成囊前期幼蟲與肌幼蟲的核苷酸序列同源性達(dá)99.8％，在第535位點(diǎn)上有一個(gè)T→C突變，在第665位點(diǎn)上有一個(gè)T→C突變；與成蟲的同源性同樣為99.8％，在第535位點(diǎn)上有一個(gè)T→C突變，在848位點(diǎn)上有一個(gè)A→G突變；肌幼蟲與成蟲相比，同源性為99.8％，在第665位C→T、在848位A→G。導(dǎo)致與之相對應(yīng)的

5、氨基酸序列發(fā)生相應(yīng)的改變。其編碼蛋白的抗原性也很穩(wěn)定，同種不同發(fā)育時(shí)期蟲體之間的差異很小。 將真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)與pMD18-T-S/EL分別用BamHⅠ和EcoRI雙酶切，膠回收純化后連接。經(jīng)PCR、酶切鑒定，證明P49-S/EL基因按設(shè)計(jì)要求已插入表達(dá)載體中，構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA-P49-S/EL。 將家兔隨機(jī)分為A、B、C組，分別肌肉注射pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1-P49-S/

6、EL和pcDNA3.1-P49-S/EL+LipofectamineTM2000。每只家兔100μg/100μl，共免3次，每次間隔1周。首次免疫后第0d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、51d采血分離血清用ELISA法檢測抗體動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)檢測外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化。 A組家兔血清在旋毛蟲攻擊感染后21d(42d)開始檢出陽性抗體，然后迅速升高；B組家兔血清在免疫期間一直沒能檢出陽性抗體，而是在旋

7、毛蟲攻擊感染后14d(35d)開始檢出陽性抗體，而后迅速升高；C組家兔血清在3免后7d(21d)即可檢出陽性抗體，旋毛蟲攻擊感染后，血清抗體OD值有所下降，而后呈逐漸上升趨勢，第51dOD450達(dá)到2.128，與A、B兩組相比差異極顯著(P＜0.01)。 首次免疫后B組與C組家兔外周血CD4+T細(xì)胞減少；2次免疫后B組、C組仍然降低，且C組降幅較大；3免后B組持續(xù)走低，C組卻大幅上升，且高于初始水平。攻擊感染旋毛蟲后，A組CD4

8、+T細(xì)胞持續(xù)減少，至感染第30d后呈逐漸上升趨勢，仍低于初始水平；B組CD4+T細(xì)胞迅速升高，已接近初始水平，至感染后14d達(dá)到最高點(diǎn)，且高于初始水平，而后開始走低，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束已低于初始水平；C組感染后第1周CD4+T細(xì)胞迅速降低，第2周迅速升高，且高于初始水平，而后開始走低，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束已低于初始水平。經(jīng)SAS軟件分析，C組與A組、B組相比差異極顯著(P＜0.01)，B組與A組差異極顯著(P＜0.01)。 首次免疫后各組家兔外周

9、血CD8+T細(xì)胞減少。2次免疫后C組增加，A組、B組減少。3免B組繼續(xù)走低；C組繼續(xù)升高。攻擊感染旋毛蟲后，C組CD8+T細(xì)胞開始降低，而后持續(xù)上升，到第51d已高于初始水平；B組CD8+T細(xì)胞上升至感染后第14d，而后降低，感染后30d呈逐漸上升趨勢；A組感染后第1周減少，第2周升高，而后呈逐漸減少趨勢。經(jīng)SAS軟件分析，B組與C組家兔外周血CD8+T細(xì)胞數(shù)量自始至終沒有顯著差異；B組、C組與A組差異極顯著(P＜0.01)。

10、首次免疫后B組、C組家兔外周血CD4+/CD8+T細(xì)胞比值迅速升高，A組也有一定程度的提高；2次免疫后各組均出現(xiàn)不同程度的下降，其中C組降幅最大，已低于初始值；3免A組、C組升高，達(dá)初始值以上，B組繼續(xù)降低，但仍高于初始值。攻擊感染旋毛蟲后，A組繼續(xù)升高，此后在感染后第2、3周處于較低水平，比值低于初始水平，而后乘上升趨勢，第51d比值已高于初始值；B組感染旋毛蟲后，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束CD4+/CD8+比值始終維持在一個(gè)較高的水平，比值升高；C

11、組感染旋毛蟲后，開始降低，而后升高，但均高于初始值，此后呈逐漸降低趨勢，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束CD4+/CD8+比值已低于初始值。經(jīng)SAS軟件分析，A組與B組、C組差異極顯著(P＜0.01)；B組與C組差異不顯著(P＞0.05)。 每只家兔腸道檢獲的7日齡成蟲數(shù)，A組、B組和C組3組相比，A組與B組、C組差異極顯著(P＜0.01)。B組與C組差異顯著(P＜0.05)。B組成蟲減蟲率80.25％；C組成蟲減蟲率達(dá)90.45％。 平均每

12、條雌蟲體外產(chǎn)生新生蚴數(shù)，A組、B組和C組3組相比，A組與B組、C組差異極顯著(P＜0.01)。B組與C組差異顯著(P＜0.05)。B組新生蚴減蟲率81.93％；C組新生蚴減蟲率達(dá)93.53％。 平均每只家兔每克肌肉檢獲的肌幼蟲數(shù)(LPG)，A組、B組和C組3組相比，A組與B組、C組差異極顯著(P＜0.01)。B組與C組差異顯著(P＜0.05)。B組肌幼蟲減蟲率68.06％；C組肌幼蟲減蟲率達(dá)89.20％。 本研究首次克隆

13、了黑龍江豬、犬、貓旋毛蟲，美國豬旋毛蟲、旋毛形線蟲、本地毛形線蟲6個(gè)旋毛蟲隔離種的成囊前期幼蟲及黑龍江豬旋毛蟲不同發(fā)育時(shí)(成囊前期幼蟲、肌幼蟲、成蟲)蟲體49kuES抗原基因并進(jìn)行了序列比較分析。首次構(gòu)建了豬旋毛蟲成囊前期幼蟲49kuES抗原基因的真核表達(dá)載體pcDNA-P49-S/EL，并應(yīng)用重組真核表達(dá)載體pcDNA-P49-S/EL免疫家兔，結(jié)果表明重組表達(dá)載體pcDNA3.1-P49-S/EL能在家兔體內(nèi)得到表達(dá)并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體