旋毛蟲(chóng)mif基因與mcd-1基因的DNA免疫保護(hù)作用以及泛素共表達(dá)對(duì)DNA免疫影響.pdf

1、旋毛蟲(chóng)?。═richinellosis）是由旋毛蟲(chóng)（Trichinella spiralis）引起的一種危害嚴(yán)重的食源性人獸共患寄生蟲(chóng)病，是肉類食品安全性的一個(gè)重要指標(biāo)。在旋毛蟲(chóng)的長(zhǎng)期寄生生活中，分泌了大量具有免疫調(diào)節(jié)功能的蛋白，對(duì)宿主免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，以逃避宿主免疫應(yīng)答。這些分子除了其免疫調(diào)節(jié)功能外，還是潛在的疫苗候選分子，將它們應(yīng)用于疫苗研究中將具有重要意義。泛素(Ubiquitin，Ub)是一個(gè)由76個(gè)氨基酸殘基組成的小蛋白，普遍

2、存在于真核細(xì)胞中且序列高度保守。泛素依賴性的蛋白質(zhì)降解途徑是目前已知的重要的、有高度選擇性的蛋白降解途徑之一。泛素化可對(duì)DNA疫苗的免疫應(yīng)答產(chǎn)生影響。本研究克隆了2個(gè)具有免疫調(diào)節(jié)功能的旋毛蟲(chóng)分泌蛋白基因——旋毛蟲(chóng)巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（Tsmif）和旋毛蟲(chóng)半胱氨酸蛋白酶抑制因子（Tsmcd-1），構(gòu)建了pVAX1真核表達(dá)載體的DNA疫苗，在BALB/c小鼠體內(nèi)對(duì)DNA免疫保護(hù)作用進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，Tsmif和Tsmcd-1的共表達(dá)能夠

3、誘導(dǎo)特異性體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，并對(duì)旋毛蟲(chóng)感染產(chǎn)生部分的免疫保護(hù)。此外，與小鼠泛素的共表達(dá)增強(qiáng)了細(xì)胞免疫應(yīng)答，并促進(jìn)了pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1免疫產(chǎn)生的抗感染保護(hù)能力。
　　 根據(jù)GenBank中發(fā)表的旋毛蟲(chóng)mif基因（Tsmif）序列(AY050661)和旋毛蟲(chóng)mcd-1基因（Tsmcd-1）序列(DQ777102)，設(shè)計(jì)引物。以旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增出大小2個(gè)TsMIF基因片段Tsmi

4、f和Tsmif"，1個(gè)TsMCD-1基因片段Tsmcd-1。構(gòu)建了3個(gè)重組質(zhì)粒pVAX1-Tsmif、 pVAX1-Tsmcd-1和pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1;雙酶切鑒定結(jié)果顯示，陽(yáng)性質(zhì)粒分別切出3000 bp的pVAX1.0質(zhì)粒片段和大小相符的靶基因片段，即:345 bp（Tsmif）、1221 bp（Tsmcd-1）和1602 bp（Tsmif-Tsmcd-1）。序列分析結(jié)果顯示，擴(kuò)增的Tsmif和Tsmif"基因片段與

5、GenBank中已公布序列(AY050661)的核苷酸同源性和氨基酸同源性均為99.7％;擴(kuò)增的Tsmcd-1基因片段與GenBank中已公布序列(DQ777102)的核苷酸同源性為99％，氨基酸同源性為100％。
　　 以pET28(b)為載體，構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET28(b)-Tsmif、pET28(b)-Tsmcd-1和pET28(b)-Tsmif-Tsmcd-1，分別在BL21大腸桿菌中表達(dá)。SDS-PAGE表明，重

6、組蛋白rTsMIF表達(dá)于上清中，而重組蛋白rTsMCD-1與rTsMIF-TsMCD-1則主要以包涵體的形式存在。Western blot分析結(jié)果顯示3種重組蛋白均能與感染旋毛蟲(chóng)的小鼠血清反應(yīng)出現(xiàn)特異性條帶（16.5 kDa、50 kDa和63 kDa）。重組蛋白經(jīng)純化后，分別與弗氏佐劑乳化皮下注射免疫BALB/c小鼠，制備了以上3種重組蛋白的小鼠抗血清。為了檢測(cè)TsMIF與TsMCD-1的特異性抗體，以重組蛋白rTsMIF-TsMCD

7、-1作為抗原建立了間接ELISA(rTsMIF-TsMCD-1-ELISA);經(jīng)方陣試驗(yàn)確定抗原包被濃度為2.3μg/ml，血清檢測(cè)稀釋度為1∶128，抗原與抗體的最佳反應(yīng)時(shí)間為90 min。
　　 為了研究Tsmif和Tsmcd-1的DNA疫苗免疫效果，將三種重組質(zhì)粒pVAX1-TsmifpVAX1-Tsmcd-1和pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1分別用肌肉注射的方式免疫BALB/c小鼠，以PBS和pVAX1分別為空白對(duì)

8、照和空載體質(zhì)粒對(duì)照;每組20只BALB/c小鼠，共免疫2次，間隔2周。二免后14d，進(jìn)行攻蟲(chóng)保護(hù)試驗(yàn)。經(jīng)口感染旋毛蟲(chóng)感染性幼蟲(chóng)(L1)35 d后，剖殺所有小鼠分別計(jì)算肌肉荷蟲(chóng)量(LPG)。目的基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)分別用RT-PCR和Western blot進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，目的基因均在肌肉注射部位獲得了表達(dá)，pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1免疫產(chǎn)生了TsMIF和TsMCD-1的共表達(dá)蛋白。在首免后0、10、20、28d采集免疫小

9、鼠血清，用重組蛋白rTsMIF-TsMCD-1包被的間接ELISA對(duì)免疫小鼠的特異性抗體水平的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，pVAX1-Tsmif免疫沒(méi)有產(chǎn)生特異性抗體應(yīng)答;而pVAX1-Tsmcd-1和pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1免疫分別誘導(dǎo)了特異性IgG、 IgM和IgA的產(chǎn)生，但沒(méi)有檢測(cè)到特異性IgE抗體。與pVAX1-Tsmcd-1相比，pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1免疫引起了較低的抗體應(yīng)答(P＜0.05)。I

10、gG亞型分析顯示，lgG2a和IgG2b的抗體滴度顯著高于IgG1，表現(xiàn)為Th1型抗體占優(yōu)勢(shì)的體液免疫應(yīng)答。此外，對(duì)血清細(xì)胞因子含量的動(dòng)態(tài)變化的分析結(jié)果顯示，三種重組質(zhì)粒的DNA免疫均產(chǎn)生了一定水平的Th1型細(xì)胞因子(IFN-γ)，但未檢測(cè)到Th2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-5);低水平的TGF-β1可能與抑制優(yōu)勢(shì)細(xì)胞因子（IFN-γ）有關(guān);各組均未能檢測(cè)到IL-17，暗示沒(méi)有炎癥反應(yīng)的發(fā)生。二免后14 d，用流式細(xì)胞分析儀分析了免疫小

11、鼠外周血淋巴細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果顯示，3個(gè)重組質(zhì)粒免疫組的CD4+T細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，特別是pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1免疫組(P＜0.01);而pVAX1-Tsmif和pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1免疫組的CD8+T細(xì)胞的數(shù)量也顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），pVAX1-Tsmcd-1免疫組則與對(duì)照無(wú)差異（P＞0.05）;3個(gè)重組質(zhì)粒免疫的CD4+/CD8+值均高于對(duì)

12、照組，說(shuō)明重組質(zhì)粒免疫均促進(jìn)了小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖。攻蟲(chóng)保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，單獨(dú)的pVAX1-Tsmif和pVAX1-Tsmcd-1免疫均未能獲得LPG的減少，而pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1免疫組的LPG則顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），獲得了23.17％的肌幼蟲(chóng)減蟲(chóng)率，表現(xiàn)出部分的免疫保護(hù)性。
　　 為了研究靶抗原泛素化對(duì)DNA免疫的影響，我們用RT-PCR克隆了小鼠泛素基因（Ub），并構(gòu)建了與Ub共表達(dá)的重組質(zhì)粒pV

13、AX1-Ub-Tsmif、 pVAX1-Ub-Tsmcd-1和pVAX1-Ub-Tsmif-Tsmcd-1。將以上重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，Western blot沒(méi)有檢測(cè)到與重組蛋白TsMIF-TsMCD-1抗血清反應(yīng)的目的條帶，但加入蛋白酶體抑制因子MG-132后，分別檢測(cè)到了大約22 kDa、57 kDa和68 kDa的條帶，其大小與預(yù)測(cè)的泛素化蛋白Ub-TsMIF、Ub-TsMCD-1和Ub-TsMIF-TsMCD-1的大小相

14、符。體外轉(zhuǎn)染試驗(yàn)結(jié)果顯示，Ub共表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞后，表達(dá)了靶蛋白（TsMIF、TsMCD-1或TsMIF-TsMCD-1）的泛素化蛋白;泛素化促進(jìn)了靶蛋白在BHK細(xì)胞內(nèi)的降解，而MG-132可以抑制這種降解作用。隨后，將Ub共表達(dá)重組質(zhì)粒分別用肌肉注射的方式免疫BALB/c小鼠，以PBS和pVAX1、pVAX1-Ub分別為空白對(duì)照和空載體質(zhì)粒對(duì)照、泛素免疫對(duì)照。通過(guò)檢測(cè)特異性抗體應(yīng)答、血清細(xì)胞因子水平和外周血CD4+T細(xì)胞和C