旋毛蟲(chóng)分子分類(lèi)和49ku結(jié)構(gòu)基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)研究.pdf

1、18S rRNA基因是一類(lèi)編碼核糖體小亞基RNA、長(zhǎng)約1800bp的DNA序列,由于在生物體內(nèi)含量較大占80﹪左右,且在進(jìn)化過(guò)程中非常保守,核苷酸的替換率較低,因而它是探討生物高級(jí)分類(lèi)群系統(tǒng)演化的難得工具之一.該實(shí)驗(yàn)克隆并比較了旋毛蟲(chóng)5個(gè)隔離種的18S rRNA基因序列,分析他們的同源性,為旋毛蟲(chóng)的分類(lèi)和診斷開(kāi)辟了新的途徑.旋毛蟲(chóng)排泄分泌(Excretory-Secretory antigen,ES)抗原,即旋毛蟲(chóng)生長(zhǎng)過(guò)程中的排泄分泌產(chǎn)

2、物,是旋毛蟲(chóng)檢測(cè)和免疫的良好抗原.該實(shí)驗(yàn)將本地毛形線蟲(chóng)(Trichinella nativa)ES抗原的49ku結(jié)構(gòu)基因構(gòu)建到桿狀病毒表達(dá)載體上,并在昆蟲(chóng)細(xì)胞中得到表達(dá).該實(shí)驗(yàn)以NCBI中U60231序列為參考,設(shè)計(jì)并合成引物,用改進(jìn)的AGPC方法結(jié)合Trizol LS試劑盒提取旋毛蟲(chóng)總RNA,用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的質(zhì)量.然后用特異性引物,對(duì)旋毛蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)隔離種旋毛形線蟲(chóng)(Trichinella spiralis)和本地毛形線蟲(chóng)(Tric

3、hinella nativa),以及分離自黑龍江省的豬旋毛蟲(chóng)、犬旋毛蟲(chóng)和貓旋毛蟲(chóng)5個(gè)旋毛蟲(chóng)隔離種進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增目的基因18S rRNA片段,均擴(kuò)增出1800bp左右的基因片段.將目的基因與克隆載體pMD18-T連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109中,篩選陽(yáng)性重組子,并將陽(yáng)性質(zhì)粒送有關(guān)生物公司測(cè)序,同時(shí)在哈爾濱獸醫(yī)研究所生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室也進(jìn)行測(cè)序.用DNAstar和Genedoc軟件分析結(jié)果顯示,18S rRNA基因的種間同源性很高,均在

4、99﹪以上.豬旋毛蟲(chóng)與旋毛形線蟲(chóng)的同源性為99.4﹪,犬旋毛蟲(chóng)與本地毛形線蟲(chóng)的同源性為99.3﹪,貓旋毛蟲(chóng)與旋毛形線蟲(chóng)比與本地毛形線蟲(chóng)的同源性要略高0.4﹪.因此,豬旋毛蟲(chóng)與旋毛形線蟲(chóng),犬旋毛蟲(chóng)與本地毛形線蟲(chóng)的親緣關(guān)系更近,這與傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)的結(jié)果相符合.本地毛形線蟲(chóng)和豬旋毛蟲(chóng)的18S rRNA基因序列已經(jīng)提交NCBI,序列號(hào)分別為AY487254和AY497012.這為旋毛蟲(chóng)分類(lèi)學(xué)的研究開(kāi)創(chuàng)了一種新的方法和思路.根據(jù)BAC-TO-BAC桿

5、狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的供體質(zhì)粒,設(shè)計(jì)表達(dá)引物,從克隆質(zhì)粒上擴(kuò)增本地毛形線蟲(chóng)49ku ES結(jié)構(gòu)基因,酶切后與供體質(zhì)粒連接,在大腸桿菌中克隆,將克隆有外源基因的供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞,該細(xì)胞含有桿狀病毒穿梭載體,供體質(zhì)粒中的外源基因在輔助質(zhì)粒編碼的轉(zhuǎn)座酶作用下,通過(guò)轉(zhuǎn)座而插入桿狀病毒基因組中,篩選含有重組質(zhì)粒的Bacmid DNA,用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞獲得重組病毒.SDS-PAGE電泳顯示表達(dá)蛋白為36ku的融合蛋白,將表達(dá)產(chǎn)