旋毛蟲肌幼蟲體外培養(yǎng)的研究.pdf

1、旋毛蟲病是一種嚴重的食源性人獸共患寄生蟲病,其病原體為旋毛形線蟲[Trichinella spiralis(Owen,1835)Railliet,1895],主要因生食或半生食含有旋毛蟲幼蟲的豬肉及其他動物肉類而感染,臨床上在急性期有持續(xù)性高熱、眼瞼和面部水腫、全身性肌肉酸痛、過敏性皮疹、血中嗜酸性粒細胞增多等變態(tài)反應性表現,重癥患者可因并發(fā)癥而死亡。國際旋毛蟲病委員會(International Commission on Trich

2、inellosis,ICT)在1995-1997年間報道1萬多例病人,現已被列入再度肆虐的疾病(re-emerging disease)。目前,由于旋毛蟲不能在體外傳代培養(yǎng),阻礙了其侵入宿主分子機制、感染宿主后腸道排蟲反應分子機制、抗旋毛蟲藥物篩選及旋毛蟲疫苗研制等的研究,因此,旋毛蟲肌幼蟲體外培養(yǎng)的研究就顯得尤其重要。
　　本研究將旋毛蟲肌幼蟲在不同液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),觀察幼蟲蛻皮時間及培養(yǎng)不同時間后蛻皮幼蟲的比例,并對未蛻皮

3、肌幼蟲長度進行測量:觀察液體培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基+T84細胞)、半固體培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基+瓊脂糖、完全培養(yǎng)基+瓊脂糖+T84細胞)對幼蟲蛻皮的影響;在半固體培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基+瓊脂糖+Caco-2細胞)中觀察幼蟲經不同活化物處理后對其蛻皮的影響,并比較2種腸上皮細胞對幼蟲蛻皮的影響。
　　材料與方法：1.旋毛蟲蟲種、實驗動物與細胞系本研究中所用的旋毛蟲為旋毛蟲河南株(Trichinella spiralis,T1),昆明小鼠傳代保種

4、,人工消化法和貝氏法收集純凈的旋毛蟲肌幼蟲;實驗動物為健康雄性6 w齡昆明小鼠和Sprague Dawley(SD)大鼠;所用細胞為人結腸癌細胞系(human colonic carcinoma cell line)T84和Caco-2細胞。2.大鼠腸內容物與小鼠膽汁的制備①將禁食8 h的大鼠剖殺后,將小腸用5 ml含抗生素的生理鹽水沖洗,1200 g離心10 min除去大的碎片,上清液即為腸內容物,用生理鹽水1:2稀釋后-20℃?zhèn)溆?

5、用前再用生理鹽水1:10稀釋;②將禁食8 h的惺篤噬焙?取出完整膽囊,收集膽汁后-20℃?zhèn)溆?用前用生理鹽水1:20稀釋。3.旋毛蟲肌幼蟲在培養(yǎng)液中培養(yǎng)①將新鮮肌幼蟲分別在生理鹽水、PBS、RPMI-1640培養(yǎng)液和含5％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)RPMI-1640培養(yǎng)液等4種液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng);②從培養(yǎng)第12 h開始,每隔2 h在倒置顯微鏡下觀察并記錄各組培養(yǎng)液中肌幼蟲開始蛻皮的時間;③每24 h從培養(yǎng)

6、箱取出培養(yǎng)瓶,混勻后吸取肌幼蟲鏡下觀察并計數蛻皮的幼蟲并拍照;選取約15條兩端均未見明顯蛻皮的幼蟲拍照后測量長度。4.旋毛蟲肌幼蟲在3種不同培養(yǎng)基中的培養(yǎng)將新鮮的肌幼蟲在大鼠腸內容物中孵育后分別在完全培養(yǎng)基(含10％FBS DMEM/F12培養(yǎng)基)+T84細胞、半固體培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基+1.75％瓊脂糖)、半固體培養(yǎng)基+T84細胞中培養(yǎng)24 h,鏡下觀察并計數1期(未蛻下完整表皮的幼蟲)及2~4期(蛻下完整表皮的幼蟲)的幼蟲。5.不同活

7、化物對培養(yǎng)幼蟲蛻皮的影響將新鮮的肌幼蟲分別在生理鹽水、RPMI-1640培養(yǎng)液、大鼠腸內容物或小鼠膽汁孵育后,懸浮至半固體培養(yǎng)基(含10％FBSDMEM培養(yǎng)基+1.75％瓊脂糖),并覆蓋至Caco-2細胞層進行培養(yǎng),24 h后鏡下觀察并計數1期及2~4期的幼蟲。6.腸上皮細胞對培養(yǎng)幼蟲蛻皮的影響在半固體培養(yǎng)基中觀察T84和Caco-2細胞對培養(yǎng)幼蟲蛻皮的影響。
　　結果：1.旋毛蟲肌幼蟲開始蛻皮時間的觀察在37℃5％CO2條件下,

8、肌幼蟲在RPMI-1640培養(yǎng)液、PBS、含5％FBS RPMI-1640培養(yǎng)液及生理鹽水中開始蛻皮的時間分別為15 h、19 h、23 h及37 h,蛻皮多數從幼蟲尾端開始。2旋毛蟲肌幼蟲活動性和蛻皮情況的觀察旋毛蟲肌幼蟲接種至培養(yǎng)液時非?；钴S,做伸展和卷曲運動,在生理鹽水和PBS中培養(yǎng)3 d活動性即明顯下降,5 d后基本不活動,在含5％FBS RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)至21 d時部分蟲體仍有活動;幼蟲在生理鹽水和PBS中僅蛻皮