旋毛蟲與偽旋毛蟲肌幼蟲抗原的研究.pdf

1、目前,國際上已將旋毛蟲屬分為8個種,即旋毛蟲(Trichinella spiralis,T1)、鄉(xiāng)土旋毛蟲(T.native,T2)、布氏旋毛蟲(T.britovi,T3)、偽旋毛蟲(T.pseudospiralis,T4)、米氏旋毛蟲(T.murrelli,T5)、納氏旋毛蟲(T.nelsoni,T7)、巴布亞旋毛蟲(T.papuae,T10)、津巴布韋旋毛蟲(T.zimbabwensis,T11)以及3個分類地位尚未確定的基因型(g

2、enotype)即Trichinella T6、T8和T9。其中偽旋毛蟲、巴布亞旋毛蟲和津巴布韋旋毛蟲為無囊包的旋毛蟲。由于不同種旋毛蟲的地理分布、宿主范圍、對宿主的致病性及宿主對不同蟲種的免疫應(yīng)答等方面存在有明顯差異,故旋毛蟲抗原的研究對旋毛蟲病的發(fā)病機(jī)理、免疫診斷及免疫預(yù)防等均具有重要意義。
　　為了觀察旋毛蟲和偽旋毛蟲抗原的差異,本文應(yīng)用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和雙向電泳技術(shù)(Two-dimen

3、sional electrophoresis,2-DE)對旋毛蟲和偽旋毛蟲肌幼蟲的蟲體可溶性抗原(soluble antigen,Sag)及排泄分泌(excretory-secretory,ES)抗原進(jìn)行了分析。
　　材料與方法：1.旋毛蟲種與感染動物本實(shí)驗所用的旋毛蟲蟲種為旋毛蟲(T1)和偽旋毛蟲(T4),均引自國際旋毛蟲參考中心,由本教研室昆明小鼠傳代保種。4周齡健康雄性SD大鼠購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心。將不同旋毛蟲蟲種

4、感染SD大鼠后8周處死,全身肌肉人工消化后收集純凈的肌幼蟲。2.肌幼蟲可溶性抗原與ES抗原的制備將人工消化后收集純凈的旋毛蟲肌幼蟲加入組織裂解液,放入勻漿器中在冰浴上研磨約1~2h,隨后在超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎,離心收集上清。將純凈的旋毛蟲肌幼蟲置于含有1640培養(yǎng)基(不含血清)的培養(yǎng)皿中,在5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20~24h,收集上清,透析和冷凍干燥后得到純化ES抗原。Bradford方法測蛋白濃度后,分裝,—80℃保存。3.十二烷基磺

5、酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將制備好的T1、T4肌幼蟲可溶性抗原和ES抗原進(jìn)行SDS-PAGE,染色后觀察不同分子量的電泳條帶,然后用GeneGenius凝膠圖像分析儀獲得圖像并加以分析,尋找T1和T4的差異蛋白帶。4.雙向電泳(2-DE)應(yīng)用等電聚焦(IEF)電泳和SDS-PAGE將T1、T4肌幼蟲可溶性抗原和ES抗原的蛋白分離,每種樣品重復(fù)3次,染色后得到蛋白雙向電泳圖譜,應(yīng)用PowerLook1120型圖像掃描儀(

6、分辨率為300bpi,像素8bits)獲得凝膠圖像,經(jīng)ImageMaster2D Platinum6.0凝膠圖像分析軟件進(jìn)行圖像調(diào)整、點(diǎn)檢測、點(diǎn)匹配、數(shù)據(jù)分析后,找出差異蛋白點(diǎn)。
　　結(jié)果：1.T1、T4肌幼蟲可溶性抗原的SDS-PAGE結(jié)果通過SDS-PAGE分析,發(fā)現(xiàn)T1肌幼蟲可溶性抗原蛋白有22條帶(221.62 kDa~14.88 kDa),其中主帶5條(115.19、65.56、53.93、29.08、14.88 kDa

7、)的蛋白量占可溶性抗原蛋白總量的47.4％。T4肌幼蟲可溶性抗原蛋白有18條帶(185.28 kDa~14.27 kDa),其中主帶7條(119.30、68.56、56.1、48.50、40.74、28.36、14.27 kDa)的蛋白量占可溶性蛋白總量的66.7％。T1肌幼蟲可溶性抗原具有6條特異的蛋白帶(59.72、44.37、23.66、22.36、18.26、16.34 kDa),而T4肌幼蟲可溶性抗原具有4條特異的蛋白帶(13

8、2.60、119.30、35.26、31.02 kDa)。2.T1、T4肌幼蟲ES抗原的SDS-PAGE結(jié)果通過SDS-PAGE分析,發(fā)現(xiàn)T1肌幼蟲ES抗原具有10條蛋白帶(113.21 kDa~14.37 kDa),其中4條主帶(55.65、50.41、43.61、14.37 kDa)的蛋白量占ES抗原蛋白總量的85.7％。T4肌幼蟲ES抗原9條蛋白帶(104.71kDa~14.51 kDa),其中4條主帶(54.58、36.80、2

9、1.70、14.51 kDa)的蛋白量占ES抗原蛋白總量的81.3％。T1、T4肌幼蟲ES抗原的蛋白帶均不相同。3.T1、T4肌幼蟲可溶性抗原、ES抗原的SDS-PAGE結(jié)果比較T1肌幼蟲可溶性抗原的8條蛋白帶(115.19、53.94、48.97、44.37、29.08、22.36、19.27、14.88 kDa)與ES抗原的8條蛋白帶(113.21、55.65、50.41、43.61、31.42、22.21、19.67、14.37

10、kDa)分子量相近。T4肌幼蟲可溶性抗原的5條蛋白帶(56.11、35.26、28.36、20.65、14.27 kDa)與ES抗原的5條蛋白帶(54.58、36.80、28.91、21.70、14.51 kDa)分子量相近。4.T1、T4肌幼蟲可溶性抗原的雙向電泳結(jié)果T1肌幼蟲可溶性抗原具有193±12個蛋白點(diǎn),匹配點(diǎn)數(shù)為150個,匹配率為81％,分子量主要為11~22 kDa、25~64 kDa及100~144 kDa,所對應(yīng)的等電

11、點(diǎn)(isoelectric point,pI)分別為4.7~8.2、4.5~6.5及5~7;T4肌幼蟲可溶性抗原具有175±9個蛋白點(diǎn),匹配點(diǎn)數(shù)為141個,匹配率為82％,分子量主要為12~21 kDa及25~90 kDa,所對應(yīng)的pI分別為4~9.5及4.5~9.6。5.T1、T4肌幼蟲ES抗原的雙向電泳結(jié)果T1肌幼蟲ES抗原具有82±6個蛋白點(diǎn),匹配點(diǎn)數(shù)為74個,匹配率為84％,分子量主要為13~16 kDa、18~22 kDa及4

12、0~55 kDa,所對應(yīng)的p1分別為4~7、3.8~6.2及5~9;T4肌幼蟲ES抗原69±5個蛋白點(diǎn),匹配點(diǎn)數(shù)為57個,匹配率為80％,分子量主要為10~15 kDa、17~25 kDa及29~55 kDa,所對應(yīng)的pI分別為4.7~6.5、4.6~6及5~7。
　　結(jié)論：1.旋毛蟲與偽旋毛蟲肌幼蟲可溶性抗原蛋白組份均多于其ES抗原。2.旋毛蟲肌幼蟲可溶性抗原及ES抗原的蛋白組份與偽旋毛蟲的均不相同。旋毛蟲肌幼蟲可溶性抗原及ES