旋毛蟲肌幼蟲親肌肉抗原基因的克隆、表達及免疫學(xué)特性的研究.pdf

1、旋毛蟲病是一種由旋毛蟲感染引起的食源性人獸共患寄生蟲病,可以感染人和多種哺乳動物。人類主要因生食或半生食含有幼蟲囊包的豬肉而感染。隨著人們飲食習(xí)慣的改變,野生動物和馬肉成為人旋毛蟲病的新感染源。世界上許多國家都有該病爆發(fā)的報道,該病對動物養(yǎng)殖和食品安全都產(chǎn)生了較大影響。因此,研制抗旋毛蟲病的疫苗具有較大的經(jīng)濟價值。
　　預(yù)防寄生蟲感染的常用方法是利用其天然抗原或重組蛋白抗原對宿主進行免疫,宿主體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體進而起到保護作用。利

2、用動物實驗的方法,已有旋毛蟲蟲體提取物、ES產(chǎn)物及其它重組蛋白疫苗研究的報道。如p43、p53核酸疫苗,經(jīng)動物實驗證實,該疫苗對宿主具有一定的免疫保護作用。但是旋毛蟲抗原成分非常復(fù)雜,并且不同發(fā)育期具有特異性,已經(jīng)研制出的核酸疫苗保護作用一般,我們應(yīng)該積極尋找更加有效的抗原基因。
　　從本實驗室已構(gòu)建的旋毛蟲感染動物模型中,利用人工消化法收集肌幼蟲,利用RT-PCR的方法克隆一個新的旋毛蟲肌幼蟲基因。測序結(jié)果與已發(fā)表的基因序列比對

3、,結(jié)果證實二者來自同一基因。再利用原核表達、蛋白純化、Western Blot的方法,獲得重組蛋白,結(jié)果證實該蛋白具有抗原性,為疫苗的研制打下理論基礎(chǔ)。
　　目的:
　　克隆一個新的旋毛蟲肌幼蟲基因即親肌肉抗原(Myophilin),并分析其序列同源性。然后進行原核表達,并對表達出的蛋白利用Western Blot的方法分析其免疫學(xué)特性,為旋毛蟲病疫苗的研制提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　在GenBank旋毛蟲基

4、因組數(shù)據(jù)庫中進行檢索,獲得旋毛蟲親肌肉抗原的cDNA序列,利用Primer5.0軟件設(shè)計引物(上下游引物分別含NdeⅠ、XhoⅠ酶切位點)。收集云南株旋毛蟲肌幼蟲,提取總RNA,并以此為模板進行RT-PCR。將PCR產(chǎn)物進行2％瓊脂糖凝膠電泳,目的基因切膠回收后與克隆載體 pMD-19T分別用 NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切,酶切產(chǎn)物以3:1連接,然后轉(zhuǎn)化到DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,Amp抗性培養(yǎng)基培養(yǎng)。陽性克隆提質(zhì)粒后做 PCR及雙酶切

5、鑒定,陽性菌液進行測序,測序結(jié)果與檢索基因核苷酸序列通過DNAMAN軟件比較,分析其同源性。測序結(jié)果完全正確后構(gòu)建原核表達重組體pET22b-Myophilin,轉(zhuǎn)化到BL21中,陽性菌液鑒定成功后IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌內(nèi)表達,His-tag標(biāo)簽純化蛋白,經(jīng)SDS-PAGE鑒定重組蛋白及純化蛋白。用Western blot對該蛋白的免疫原性進行檢測。
　　結(jié)果:
　　1親肌肉抗原的RT-PCR擴增:2%瓊脂糖凝膠電泳顯示,RT

6、-PCR擴增得到1條約579bp的條帶,與預(yù)期大小相符,表明成功擴增出目的基因Myophilin。
　　2重組克隆質(zhì)粒的PCR及酶切鑒定:以重組質(zhì)粒為模板,經(jīng)PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定,得到1條與目的片段大小一致的條帶,確認(rèn)目的基因克隆成功。重組質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切,獲得大小分別為2600bp、579bp和300bp左右的3條帶,與預(yù)期結(jié)果相符,再次驗證目的基因克隆成功。
　　3親肌肉抗原序列測定及其同源性

7、分析:所測親肌肉抗原基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST,同源性為100%。
　　4重組表達載體的構(gòu)建及鑒定:表達載體pET22b利用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切,將目的基因與表達載體的連接產(chǎn)物提質(zhì)粒,做質(zhì)粒 PCR得到一條579bp的條帶,雙酶切獲得大小分別為5500bp和579bp的2條帶,與理想結(jié)果相符,證明連接成功。
　　5重組蛋白的純化鑒定:重組蛋白經(jīng)6*His標(biāo)簽的鎳柱親和層析純化后得到一條蛋白條帶,分子量約21k

8、Da。
　　6 Western Blot鑒定免疫特性:將純化蛋白進行SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)印,以感染40天旋毛蟲小鼠的血清為一抗進行Western Blot,顯色時在21kDa處有條帶,說明Myophilin具有抗原性。
　　結(jié)論:
　　1成功提取出旋毛蟲肌幼蟲總RNA,克隆出Myophilin基因。
　　2構(gòu)建了Myophilin基因的原核表達載體重組體。
　　3誘導(dǎo)表達出Myophilin蛋白,并成功純