旋毛蟲43kDa抗原基因重組質(zhì)粒pET30a（+）-Ts43的構(gòu)建與表達(dá).pdf

1、旋毛蟲是分布最為廣泛的寄生蟲之一，可感染人和150多種哺乳動(dòng)物。由旋毛蟲引起的旋毛蟲病是一種嚴(yán)重的人獸共患病，若不及時(shí)診斷和治療，患者的死亡率可達(dá)3％～30％。自1835年發(fā)現(xiàn)旋毛蟲病以來，不但未能將該病完全控制，其流行范圍反而有所擴(kuò)大，現(xiàn)已被列入再度肆虐的疾病。該病不僅嚴(yán)重危害人類健康，也給養(yǎng)豬業(yè)和食品工業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。人類主要因生食或半生食豬肉而感染，豬肉中旋毛蟲的檢疫對(duì)于預(yù)防人體旋毛蟲病非常重要。因此，目前急需建立一種快速、

2、簡(jiǎn)單、能夠廣泛應(yīng)用的旋毛蟲病診斷和檢疫方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及其在寄生蟲學(xué)上的廣泛應(yīng)用，基因重組抗原由于可大量制備、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，有希望用于肉類和肉制品中旋毛蟲的檢疫及旋毛蟲病的免疫診斷。因此，尋找具有特異性的旋毛蟲抗原基因，繼而通過基因工程技術(shù)大量制備重組蛋白抗原是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。 本研究旨在應(yīng)用基因工程方法，通過PCR擴(kuò)增出旋毛蟲肌幼蟲的Ts43基因，并通過合適的酶切位點(diǎn)，將其插入原核表達(dá)載體pET-30a(+)中

3、，構(gòu)建并表達(dá)pET30a(+)-Ts43，獲得43kDa重組蛋白。通過Westernblot分析43kDa重組蛋白的抗原活性，為進(jìn)一步用于旋毛蟲檢疫、免疫診斷及疫苗研制打下基礎(chǔ)。 材料與方法；1.旋毛蟲Ts43基因的克隆與序列分析：登陸GenBank尋找旋毛蟲43kDa抗原的cDNA序列，利用生物學(xué)軟件分析其編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽區(qū)域后設(shè)計(jì)出一對(duì)巢式引物，通過RT-PCR擴(kuò)增出43kDa的有抗原活性的全部基因序列，并將其插入

4、到克隆和表達(dá)載體pET-30a(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a(+)-Ts43，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，結(jié)果正確后測(cè)序，并通過生物學(xué)軟件Omiga2.0對(duì)Ts43抗原基因進(jìn)行序列分析和比較。 2.pET30a(+)-Ts43原核表達(dá)系統(tǒng)的篩選：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化合適的宿主大腸桿菌DH5α，經(jīng)抗生素抗性篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒后酶切電泳鑒定重組質(zhì)粒。 3.旋毛蟲Ts43基因的表達(dá)與鑒定：攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)

5、后進(jìn)行SDS-PAGE，觀察有無目的蛋白表達(dá)，并對(duì)表達(dá)結(jié)果進(jìn)行可溶性分析。應(yīng)用旋毛蟲病患者血清及旋毛蟲感染小鼠血清進(jìn)行Westernblot分析，鑒定重組蛋白的抗原活性。 結(jié)果；1.旋毛蟲43kDa抗原最可能的信號(hào)肽切割位點(diǎn)位于第22和第23位氨基酸之間。2.含旋毛蟲Ts43基因的重組質(zhì)粒pET30a(+)-Ts43，經(jīng)BamHI和HindⅢ雙酶切后得到克隆載體片段和Ts43目的基因片段(969kb)，證實(shí)Ts43基因的重組質(zhì)粒

6、構(gòu)建成功。3.測(cè)序結(jié)果表明，Ts43基因的核苷酸片段為969bp，編碼322個(gè)氨基酸；Ts43的核苷酸片段與GenBank中報(bào)道的序列同源性為99.2％，氨基酸的同源性為98.7％。發(fā)現(xiàn)7個(gè)堿基存在差異和4個(gè)氨基酸有變化。 4.SDS-PAGE表明Ts43基因在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，重組蛋白的分子量為41kDa，以誘導(dǎo)4h時(shí)表達(dá)量最多。薄層凝膠光密度掃描分析顯示，表達(dá)的融合蛋白量約占細(xì)菌總蛋白量的14.7％。 5.We

7、sternblot證實(shí)，該融合蛋白可被旋毛蟲感染的小鼠血清和旋毛蟲病患者血清識(shí)別。與人芽囊原蟲、隱孢子蟲感染的小鼠血清、正常小鼠血清及健康人血清未發(fā)生交叉反應(yīng)。然而，旋毛蟲重組抗原43kDa與并殖吸蟲病、華支睪吸蟲病、日本血吸蟲病、囊蟲病及包蟲病患者血清均有交叉反應(yīng)。 結(jié)論；1.所克隆的旋毛蟲Ts43基因的核苷酸片段為969bp，編碼322個(gè)氨基酸；Ts43的核苷酸片段與GenBank中報(bào)道的序列同源性為99.2％，氨基酸的同源