卡氏肺孢子蟲55kDa抗原基因克隆與表達.pdf

1、目的：體外擴增卡氏肺孢子蟲55kDa抗原(p55)基因及690bp的基因片段，構建原核表達載體pGEX/690，誘導表達重組蛋白。 方法：取肺孢子蟲肺炎大鼠肺組織制備卡氏肺孢子蟲(Pc)DNA，并以此模板擴增p55基因，將PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，轉化E.coliDH5a，在含氨芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)基上篩選出重組子，提取質粒、酶切鑒定及測序驗證插入的DNA片段，并進行序列比較分析；接著，用生物信息學知識分析p55

2、蛋白理化性質和抗原表位等；最后，用RT-PCR擴增p55基因690bp片段，克隆至原核表達載體pGEX-4T-1中，轉化大腸桿菌，篩選出重組子、提取質粒雙酶切、PCR、測序鑒定；并以IPTG誘導表達，SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物。 結果：PCR擴增獲得長度為1286bp的序列，測序結果與報道的基因序列相比，有三處核苷酸不同，同源性為99..8％，推導的氨基酸序列完全相同。RT-PCR擴增的片段為708bp，將其克隆入pGEX-4

3、T-1中，構建重組質粒，雙酶切獲得了一個大小與其相應PCR擴增產(chǎn)物一致的插入片段，測序驗證讀碼框架完全正確。用IPTG誘導表達，重組質粒在大腸桿菌中表達出p55與谷胱甘肽轉移酶(GST)的融合蛋白，表達產(chǎn)物主要以可溶性蛋白的形式存在，與生物信息學預測的蛋白可溶性結果相一致。重組蛋白分子量約為56kDa，表達量占菌體總蛋白的11.09％。 結論：本研究從卡氏肺孢子蟲DNA中成功獲得p55基因、成功構建了p55cDNA重組原核表達質