新孢子蟲SRS2基因的克隆、表達(dá)及ELISA方法的建立.pdf

1、新孢子蟲（Neospora caninum）是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲，主要引起牛、狗等動物的神經(jīng)肌肉性疾病和流產(chǎn)，尤其是奶牛的流產(chǎn)，嚴(yán)重影響?zhàn)B牛業(yè)的發(fā)展。新孢子蟲病的早期診斷是有效控制該病發(fā)生和蔓延的重要手段。研究表明，新孢子蟲表面蛋白NcSRS2具有較好的免疫原性，是新孢子蟲病診斷和疫苗研究的重要候選抗原。本試驗擬采用新孢子蟲表面蛋白NcSRS2建立間接ELISA診斷方法，用于牛新孢子蟲病診斷。 參考GenBank登錄的新孢

2、子蟲NcSRS2全基因序列，在163～1141處設(shè)計一對引物，通過PCR擴(kuò)增出NcSRS2的相應(yīng)片段，構(gòu)建T-A克隆，經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定和測序分析后，再亞克隆到表達(dá)載體pET-32a中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-32a-NcSRS2t，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR擴(kuò)增和酶切鑒定后，保存重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒pET-32a-SRS2t轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白NcSRS2t。Western blotting檢測，表達(dá)

3、的融合蛋白NcSRS2t能夠被新孢子蟲陽性血清所識別。 將表達(dá)的融合蛋白NcSRS2t收集、純化后作為抗原，包被聚苯乙烯微量反應(yīng)板，初步建立檢測牛新孢子蟲抗體的間接ELISA。試驗結(jié)果表明，重組蛋白的最佳包被濃度為5μg/ml，最佳封閉時間為2h，檢測血清稀釋度為1：200，抗原和抗體作用時間為1h，HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG的工作濃度為1：5000，最佳顯色時間為10min，用21mol/LH2SO4為終止液，確定陰陽性的臨界O