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文檔簡介
1、新孢子蟲(Neospora caninum)是一種專性細胞內寄生的原蟲,主要引起牛、狗等動物的神經肌肉性疾病和流產,尤其是奶牛的流產,嚴重影響?zhàn)B牛業(yè)的發(fā)展。新孢子蟲病的早期診斷是有效控制該病發(fā)生和蔓延的重要手段。研究表明,新孢子蟲表面蛋白NcSRS2具有較好的免疫原性,是新孢子蟲病診斷和疫苗研究的重要候選抗原。本試驗擬采用新孢子蟲表面蛋白NcSRS2建立間接ELISA診斷方法,用于牛新孢子蟲病診斷。 參考GenBank登錄的新孢
2、子蟲NcSRS2全基因序列,在163~1141處設計一對引物,通過PCR擴增出NcSRS2的相應片段,構建T-A克隆,經PCR鑒定、酶切鑒定和測序分析后,再亞克隆到表達載體pET-32a中,構建了重組質粒pET-32a-NcSRS2t,轉化DH5α感受態(tài)細胞,經PCR擴增和酶切鑒定后,保存重組質粒。將重組質粒pET-32a-SRS2t轉化表達菌BL21,用IPTG誘導表達融合蛋白NcSRS2t。Western blotting檢測,表達
3、的融合蛋白NcSRS2t能夠被新孢子蟲陽性血清所識別。 將表達的融合蛋白NcSRS2t收集、純化后作為抗原,包被聚苯乙烯微量反應板,初步建立檢測牛新孢子蟲抗體的間接ELISA。試驗結果表明,重組蛋白的最佳包被濃度為5μg/ml,最佳封閉時間為2h,檢測血清稀釋度為1:200,抗原和抗體作用時間為1h,HRP標記的兔抗牛IgG的工作濃度為1:5000,最佳顯色時間為10min,用21mol/LH2SO4為終止液,確定陰陽性的臨界O
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