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文檔簡介
1、豬腦心肌炎是由腦心肌炎病毒(encephalomyomyocarditis virus,EMCV)引起的以仔豬腦炎、心肌炎和心肌周圍炎為主要臨床癥狀及母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障礙為主要臨床癥狀的急性傳染病。該病是一種人畜共患病,不僅給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失,也危害了人類的健康。EMCV 2C基因參與病毒基因組的復(fù)制,其表達產(chǎn)物2C蛋白具有良好的免疫原性。本文對EMCV TJ分離株的2C基因進行了克隆,構(gòu)建了表達載體,獲得
2、了原核表達的2C蛋白,建立了檢測EMCV抗體的ELISA檢測方法,為EMC的流行病學(xué)和分子診斷奠定了基礎(chǔ)。 首先,將EMCV TJ株接種BHK-21細胞,24h后可見細胞圓縮、崩解。利用EMCV3D基因的特異性引物對出現(xiàn)細胞病變的培養(yǎng)上清進行RT-PCR擴增,結(jié)果得到286 bp的目的片段,與預(yù)期的EMCV 3D片段長度一致。 參考GenBank上EMCV的2C基因序列設(shè)計一對特異性引物,用RT-PCR技術(shù)對EMCV T
3、J株進行擴增,得到含有2C基因的特異性DNA片段。將此DNA片段繼續(xù)用2C表達引物擴增,得到完整的2C基因,EMCV TJ株2C基因全長978個bp。EMCV TJ株2C基因與其它參考毒株的同源性在80.8%~99.8%之間,其中與BJC3的同源性最高達99.8%,與HB1為99.7%,與Mengo-M同源性最低為80.8%。 其次,將預(yù)表達目的片段克隆入原核表達載體pGEX-6P-1中,在0.1mM IPTG誘導(dǎo)下pGEX-6
4、P-2C在大腸桿菌中以包涵體的形式表達,表達蛋白的大小為61.6ku。重組蛋白經(jīng)包涵體洗滌和SDS-PAGE電泳分離純化后,進行PVDF膜鑒定,結(jié)果顯示,重組蛋白可以被豬EMCV陽性血清特異性識別。 最后,以純化的2C蛋白為抗原,初步建立了檢測EMCV抗體的間接ELISA方法。用建立的間接ELISA方法,并對天津7個縣區(qū)91個規(guī)模化豬場的327份商品豬豬血清進行了檢測,結(jié)果有86個豬場的260份血樣為EMCV抗體陽性,豬場EMC
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