豬腦心肌炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C的原核表達(dá)與間接ELISA方法的建立.pdf

1、豬腦心肌炎是由腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis viurs，EMCV）引起豬的以腦炎、心肌炎或心肌周?chē)诪橹饕卣鞯募毙詡魅静?。本研究針?duì)EMCV非結(jié)構(gòu)蛋白2C基因設(shè)計(jì)合成了一對(duì)特異性引物，通過(guò)RT-PCR獲得了長(zhǎng)為1062 bp的2C基因序列，構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-2C，并在大腸桿菌BL21細(xì)胞中成功表達(dá)了62 ku預(yù)期大小的重組2C蛋白，蛋白表達(dá)量約為33.9％。重組2C蛋白于室溫保存72 h，

2、-20℃和-80℃分別保存12月，凍融9次未見(jiàn)降解。Western blot分析表明，重組2C蛋白可以被豬源或兔源抗EMCV陽(yáng)性血清識(shí)別。
　　 以純化的重組2C蛋白作為包被抗原建立了檢測(cè)EMCV抗體的間接ELISA方法，確定了方法的最佳工作條件和陰陽(yáng)性臨界值，檢測(cè)了方法的特異性、敏感性、重復(fù)性，并用該方法分析了EMCV感染動(dòng)物2C抗體的產(chǎn)生動(dòng)態(tài)。試驗(yàn)結(jié)果表明，間接ELISA的陰陽(yáng)性臨界值為0.27，以1 μg/mL的重組2C蛋

3、白于37℃包被1 h后4℃過(guò)夜，用含5％小牛血清的PBST于37℃封閉1 h，待檢血清作1?20倍、酶標(biāo)二抗作1?400倍稀釋后分別于37℃反應(yīng)1 h和45 min后，加底物后于室溫避光顯色15 min為最佳工作濃度和工作條件。重組2C抗原與豬抗CSFV、PCV2、PPV、PRV和PRRSV等5種陽(yáng)性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，EMCV可以阻斷重組抗原與腦心肌炎陽(yáng)性血清的特異性反應(yīng)。該ELISA方法與血清中和試驗(yàn)的符合率為95.7％（22/23

4、），相對(duì)敏感性為90.9％（10/11）；同一時(shí)間批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)＜10％，不同時(shí)間批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)＜15％。應(yīng)用該方法可以在EMCV感染仔豬后4 d，檢測(cè)到相應(yīng)抗體，感染后7 d抗體水平最高，隨后逐漸下降，直至感染后21 d仍然可以檢測(cè)到較低水平的2C抗體。
　　 應(yīng)用建立的間接ELISA方法檢測(cè)了2006～2008年間河北省不同地區(qū)31個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)的1306份血清樣本。結(jié)果顯示，EMCV抗體陽(yáng)性率平均為13.