IBV N基因和M基因原核表達(dá)及N蛋白間接ELISA方法的初步建立.pdf

1、雞傳染性支氣管炎病毒屬于冠狀病毒科（Coronariyidae），為不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒。N蛋白進(jìn)化上最為保守，主要與基因組核酸的包裹、RNA的復(fù)制和細(xì)胞免疫有關(guān)，含有大量抗原決定簇，免疫原性僅次于S蛋白，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生大量抗體。M蛋白及其基因在進(jìn)化中比較保守，M蛋白與病毒的復(fù)制有關(guān)，同時M蛋白可能是重要的免疫原基因。盡管目前對于IBV的免疫大多數(shù)研究都集中于S1蛋白，但I(xiàn)BV其它的結(jié)構(gòu)蛋白，如N蛋白、M蛋白與S蛋白相比保守性更

2、高，因此研究N蛋白和M蛋白對了解雞傳染性支氣管炎的診斷和防制方面有很重要的現(xiàn)實意義。通過表達(dá)具有高度保守性的N蛋白，并將其作為診斷抗原建立檢測IBV抗體的ELISA法，為監(jiān)測群體的抗體水平，預(yù)防和控制該病提供可靠的依據(jù)和有效的技術(shù)保障。同時表達(dá)M蛋白以便為下一步研究該蛋白的免疫原性奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究根據(jù)GenBank已報道的IBV的M41株的N基因和M基因序列分別設(shè)計一對引物，從提取的M41株的RNA中利用RT-PCR技術(shù)

3、分別擴增獲得了約1.23kb和678bp的片段，將這兩個片段分別插入克隆載體pMD18-T，經(jīng)測定核苷酸序列證實N基因和M基因都擴增正確，表明已成功構(gòu)建pMD18-T-N和pMD18-T-M。再將pMD18-T-N和pMD18-T-M用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，將酶切后的N基因和M基因片段分別克隆到表達(dá)載體pET-32a中，分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rossetta中，分別用IPTG誘導(dǎo)，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)果顯示：其中N蛋白有

4、了表達(dá)且為可溶性的蛋白，N蛋白有兩種產(chǎn)物，大小分別約為63 kD和55kD，且Western blot檢測可與相應(yīng)IBV病毒抗體發(fā)生特異性的反應(yīng)也出現(xiàn)兩條帶，表明表達(dá)的N蛋白有一定的生物活性；M蛋白也有表達(dá)，且也為可溶性的蛋白，條帶約為30kD，Western blot檢測可與相應(yīng)IBV病毒抗體發(fā)生特異性的反應(yīng)，說明表達(dá)的M蛋白有很好的免疫學(xué)活性。
　　 本研究在進(jìn)行N蛋白的原核表達(dá)之后，用純化的傳染性支氣管炎病毒（IBV）重組

5、核蛋白（N蛋白）包被ELISA板，建立了檢測IBV的間接ELISA方法，其中抗原的最佳包被濃度是1.80μg/ml，血清的最佳稀釋度為1:80，二抗的最佳工作濃度為1:5000；統(tǒng)計學(xué)分析后確定陰陽性的臨界值為0.351（X+3×SD=0.18+3×0.057）。該方法特異性好，與其它禽類病霉（NDV、IBDV、EDS76V、AIV）標(biāo)準(zhǔn)陽性血清均無交叉反應(yīng)：進(jìn)行批間批內(nèi)重復(fù)試驗的結(jié)果是變異系數(shù)均小于8％，表明具有良好的重復(fù)性；用IDE