PRRSV的RdRp、ORF3和ORF5基因的原核表達(dá)及間接ELISA方法的建立.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是20世紀(jì)80年代末發(fā)現(xiàn)的一種高度傳染性疾病，能引起妊娠母豬的流產(chǎn)、死胎、木乃伊等繁殖障礙癥狀，以及各種年齡豬（特別是仔豬）的呼吸道癥狀。PRRSV感染能降低豬體免疫力，常引起其他病原微生物的繼發(fā)或并發(fā)感染，加重病情。該病在世界許多國家和地區(qū)的廣泛流行，已經(jīng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。我國自19

2、95年爆發(fā)此病以來，現(xiàn)已成為規(guī)?；i場引發(fā)豬繁殖障礙和呼吸道疾病的主要病原之一．特別是這兩年爆發(fā)的高致病性藍(lán)耳病，更是對國內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)造成了沉重打擊。為了更有效的預(yù)防和控制PRRSV的爆發(fā)，本研究對PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白（RdRp）和結(jié)構(gòu)蛋白（ORF3、ORF5）進(jìn)行了克隆、表達(dá)，并用表達(dá)產(chǎn)物建立了檢測PRRSV抗體的間接ELISA方法，結(jié)果如下： 1、根據(jù)GenBank中豬繁殖與呼吸道綜合征病毒（PRRSV）的基因序列，分別針對

3、PRRSVRdRp、ORF3和ORF5基因設(shè)計3對特異性引物，通過RT—PCR方法，將PRRSV RdRp、ORF3和ORF5基因克隆入pMD18—T載體，篩選出陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，分別得到了約為720bp、585bp和498bp大小的目的片段。 2、將目的基因片段RdRp、ORF3和ORF5克隆到原核表達(dá)載體Pet—32a（+），構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒Pet—RdRp、Pet—ORF3和Pet—ORF5。并將其轉(zhuǎn)化至BL21中，用

4、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，分別得到分子量約為46KDa、42KDa和38KDa重組蛋白。 3、將大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，利用His—Bind蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化，以純化后的重組蛋白作為診斷抗原，通過對抗原濃度、血清濃度和血清作用時間等ELISA條件的摸索，初步建立了一套檢測PRRSV抗體的間接ELISA方法。 本研究成功地對廣東地區(qū)PRRSV流行株進(jìn)行了分離、鑒定，并對RdRp、ORF3和ORF5幾個基因克隆及蛋白的原核表達(dá)和間