豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF3和ORF5基因的克隆及在昆蟲細胞中的表達.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征是一種嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病，主要引起母豬繁育障礙和仔豬及生長豬呼吸系統(tǒng)疾病。PRRSV是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，含有8個開放閱讀框，其中由ORF3編碼的GP3蛋白是PRRSV的次要結構蛋白，在毒株間保守性差，在病毒的致病性、病毒復制、病毒裝配、病毒變異和保護性等方面可能具有重要意義。由ORF5基因編碼病毒的糖基化包膜蛋白(E蛋白)，是主要的結構蛋白，參與細胞免疫與體液免疫，刺激機體產(chǎn)生中和抗體。因此研究ORF

2、3、ORF5基因的克隆及表達，對于研制新型疫苗和特異診斷抗原具有重要意義。本試驗構建了重組克隆載體T-ORF3、T-ORF5，并將ORF3、ORF5分別克隆到桿狀病毒表達載體中，在昆蟲細胞Sf9中表達，為后續(xù)試驗奠定了基礎。具體操作如下：
　　 1.本試驗從蘭州某豬場采集感染PRRSV的豬肺臟組織，提取總RNA，根據(jù)GenBank中公布的PRRSV中國代表株Ch-1a基因序列，設計包含完整ORF3、ORF5序列的2對特異引物，利

3、用RT-PCR技術擴增ORF3、ORF5基因，將產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，構建重組克隆載體T-ORF3、T-ORF5并進行序列測定?；驕y序結果表明克隆得到的ORF3、ORF5基因片段長度分別為765bp、603bp；同國內(nèi)外其它13個代表毒株的核苷酸同源性為88.0％～99.2％、87.3％～99.0％；推導的編碼氨基酸的同源性為86.7％～98.8％、85.6％～98.5％。
　　 2.將ORF3、ORF5分別克隆到桿狀

4、病毒表達載體pFastBacTMHT A中，獲得重組轉(zhuǎn)座載體pFastBacHTA-ORF3、pFastBacHTA-ORF5，將經(jīng)酶切及測序鑒定為陽性的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進含穿梭質(zhì)粒Bacmid的感受態(tài)細胞DH10Bac中，發(fā)生轉(zhuǎn)座作用，經(jīng)監(jiān)白斑篩選得到含有ORF3、ORF5基因的重組穿梭載體Bacmid-ORF3、Bacmid-ORF5，以脂質(zhì)體介導的方法將重組穿梭載體轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞，獲得重組病毒。PCR鑒定證實目的基因片段已重組到桿狀病