豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF3、ORF5基因的克隆、核酸疫苗構(gòu)建及實驗免疫研究.pdf

1、本文根據(jù)已發(fā)表的PRRSV國內(nèi)分離株BJ-4株的核苷酸序列，設(shè)計了兩對引物，用RT-PCR的方法擴增了PRRSV長春分離株ORF5、ORF3兩個重要的免疫原性基因，經(jīng)凝膠電泳回收后克隆到pMD-18T載體上，酶切鑒定證實后進行序列測定。序列分析表明PRRSV長春分離株與標(biāo)準美洲株的氨基酸同源性較高，ORF3基因氨基酸的同源性達92.4％，ORF5基因氨基酸的同源性達88.7％，表明PRRSV長春分離株屬于美洲型。 將擴增后獲得的

2、PRRSV長春分離株ORF5、ORF3基因，克隆到真核表達載體pVAX1及pVIR-IL-18的啟動子CMV下游，構(gòu)建成真核表達質(zhì)粒pVAX1-ORF5、pVAX1-ORF5-ORF3及含有豬白細胞介素IL-18的核酸疫苗pVIR-IL18-ORF5、pVIR-IL18-ORF5-ORF3。通過Western-blot以及IFA等檢測方法確認，所構(gòu)建的4個重組DNA疫苗質(zhì)粒在真核細胞能進行有效的轉(zhuǎn)錄，并表達了目的蛋白(GP5)、(GP3

3、)。 將所構(gòu)建的4個重組DNA疫苗質(zhì)粒進行了Balb/c小鼠免疫試驗，檢測了免疫后的ELISA抗體水平和脾T淋巴細胞亞群數(shù)量。結(jié)果表明：共表達豬IL-18基因的核酸疫苗pVIR-IL-18-ORF5、pVIR-IL18-ORF5-ORF3免疫后的ELISA抗體水平和脾T淋巴細胞亞群數(shù)量均優(yōu)于pVAX1-ORF5，pVAX1-ORF5-ORF3。所構(gòu)建的核酸疫苗體液免疫水平不如滅活苗理想，細胞免疫水平好于滅活苗說明所構(gòu)建的核酸苗能