豬繁殖與呼吸綜合征雙基因及佐劑活病毒載體疫苗與DNA疫苗研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以妊娠母豬嚴(yán)重繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的傳染病。PRRS自1987年首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)于美國以來，現(xiàn)已遍及世界各主要養(yǎng)豬國家與地區(qū)，并已成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一。同其它多數(shù)病毒病的防制一樣，免疫接種仍是預(yù)防與控制PRRS的主要措施。目前用于預(yù)防PRRS的主要商用疫苗是傳統(tǒng)常規(guī)疫苗弱毒疫苗和滅活疫苗。但已證實(shí)弱毒苗存在散毒及高幾率毒力返強(qiáng)

2、的安全隱患，國外許多國家已禁用弱毒苗。滅活苗盡管安全性較好，但不僅需多次重復(fù)接種，而且免疫效果不理想，還經(jīng)常可導(dǎo)致免疫失敗。因此，迫切需要更安全、高效、廉價(jià)的新型疫苗來預(yù)防和控制PRRS的發(fā)生與流行。 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)是新近發(fā)展和建立起來的一種富有生命力的新技術(shù)。其高效的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能和在細(xì)胞間自主傳遞的特點(diǎn)，為提高新型疫苗免疫效應(yīng)提供了新的思路和有效手段。目前已證實(shí)具有獨(dú)特蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)特性的來源于a-皰疹病毒亞科的VP22同源物，能顯著提高

3、與之融合的外源蛋白的遞呈效率進(jìn)而提高其免疫原性，并證實(shí)可顯著提高DNA疫苗或腺病毒載體疫苗的免疫效應(yīng)，其中牛皰疹病毒1型(BHV-1)VP22是極具開發(fā)應(yīng)用潛力的新型高效的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)免疫增強(qiáng)佐劑分子。 鑒于此，本研究以PRRSV兩個(gè)最主要的保護(hù)性抗原基因…經(jīng)修飾具有更好免疫原性的ORF5基因(ORF5M)以及ORF6基因?yàn)榘谢颍訠HV-1 VP22為免疫增強(qiáng)佐劑分子，開展了以偽狂犬病毒(PRV)為載體的PRRS雙基因及佐劑活病

4、毒載體疫苗以及PRRS雙基因及佐劑DNA疫苗研究，主要研究內(nèi)容如下： 1、雙基因及佐劑重組偽狂犬病毒TK<'->／gE<'->／VP22E<'+>／VP22M<'+>的構(gòu)建與免疫反應(yīng) 采用PCR方法從含：BHV-1 VP22基因及PRRSV ORFSM基因的質(zhì)粒中，擴(kuò)增到不含終止子的VP22基因以及ORF5M基因的完整編碼區(qū)，并進(jìn)行了克隆和序列分析，經(jīng)序列測定證實(shí)兩基因均未發(fā)生堿基突變。將ORF5M及VP22基因依

5、次插入到PRV通用轉(zhuǎn)移載體pIECMV中，構(gòu)建了含VP22-ORF5M融合基因的PRV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒plECMV-VP220RF5M。再將與VP22基因融合的PRRSV ORF6基因表達(dá)盒插入到plECMV-VP220RF5M中，構(gòu)建了含VP22-ORF5M與VP22-ORF6融合基因的PRV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pIECMV-VP220RF5M-VP220RF6。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒與EcoRI線性化后的PRV gE基因缺失標(biāo)記疫苗株TK<'->／

6、gE<'->／LacZ<'+>基因組共轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞，出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)的轉(zhuǎn)染產(chǎn)物經(jīng)蝕斑純化結(jié)合PCR擴(kuò)增篩選，構(gòu)建了融合表達(dá)VP22與ORF5M基因的單基因及佐劑重組偽狂犬病毒(rPRV)TK<'->／gE<'->／VP22E<'+>，以及共表達(dá)與VP22融合的ORF5M與ORF6基因的雙基因及佐劑rPRVTK<'->／gE<'->／VP22E<'+>／VP22M<'+>，并經(jīng)：PCR、Southern blot、Weste

7、rn blot、IFA證實(shí)構(gòu)建正確，外源融合基因得到表達(dá)，并具有免疫學(xué)活性。而且外源基因的插入不影響rPRV在IBRS-2或PK-15細(xì)胞上的增殖。 2、PRRS雙基因及佐劑DNA疫苗pCI-VP22ORF5M-VP22ORF6的構(gòu)建與免疫反應(yīng) 將BHV-1 VP22基因以及PRRSV ORF5M基因依次插入到真核表達(dá)載體pCI-neo中，構(gòu)建了融合表達(dá)VP22與ORF5M基因的單基因及佐劑DNA疫苗表達(dá)質(zhì)粒pCI-VP

8、22ORFSM。再將VP22-ORF6融合基因表達(dá)盒插入到pCI-VP22ORF5M中，構(gòu)建了共表達(dá)與VP22融合的ORF5M及ORF6基因的雙基因及佐劑DNA疫苗表達(dá)質(zhì)粒pCI-VP22ORF5M-VP22ORF6，經(jīng)IFA和Western blot證實(shí)，外源融合基因得到表達(dá)，并具有免疫學(xué)活性。將單/雙基因及佐劑DNA疫苗免疫BALB/c小鼠，并與單/雙基因DNA疫苗pCI-ORF5M與pCI-ORF5M-ORF6進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，

9、4種DNA疫苗誘導(dǎo)體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力從低到高順序均為：單基因DNA疫苗＜單基因及佐劑DNA疫苗＜雙基因DNA疫苗＜雙基因及佐劑DNA疫苗。其中，單基因及佐劑DNA疫苗誘導(dǎo)的ELISA抗體、中和抗體水平與淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)與相應(yīng)的單基因DNA疫苗相比差異均顯著。較之于單基因DNA疫苗，雙基因及佐劑DNA疫苗誘導(dǎo)的ELISA抗體和中和抗體均比雙基因DNA疫苗更為顯著。而且雙基因及佐劑DNA疫苗誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)與相應(yīng)的雙基因DNA疫