豬繁殖與呼吸綜合征病毒自殺性DNA疫苗及其菌蛻復(fù)合疫苗的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的傳染病。PRRSV GP5目前被認(rèn)為是研制PRRS新型分子診斷試劑和新型疫苗的良好材料?！白詺⑿浴盌NA疫苗不僅具有常規(guī)DNA疫苗易制備、運(yùn)輸、保存等優(yōu)點(diǎn)，還具有安全性與有效性。菌蛻是沒有細(xì)胞內(nèi)容物的革蘭氏陰性菌的細(xì)胞膜，它可以靶向于免疫系統(tǒng)并作為免疫佐劑。另外，菌蛻可作為呈遞蛋白、藥物、DNA、和其他水溶物的載體。鑒于此，本課題以菌蛻作為載體，

2、與表達(dá)PRRSV ORF5基因的“自殺性”DNA疫苗制備成PRRSV“自殺性”DNA菌蛻復(fù)合疫苗，再進(jìn)行小白鼠的免疫試驗(yàn)。主要研究內(nèi)容如下： 通過RT—PCR擴(kuò)增采自重慶地區(qū)不同豬場(chǎng)高熱病病豬肺組織樣本中PRRSV的ORF5全序列，并將該序列克隆進(jìn)pMD18—T載體進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果8個(gè)樣本中有5個(gè)成功擴(kuò)增出大小為603bp的ORF5全序列。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明它們與國內(nèi)2006-2007年間的分離株親緣關(guān)系較近，而與更早的分離株和疫苗

3、株MLV親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。此外，推導(dǎo)氨基酸序列分析表明：重慶地區(qū)流行的PRRSV與以JXA1等為代表的同期其它地區(qū)分離株相比較，在ORF5的兩個(gè)線性抗原表位中存在獨(dú)特性變異。 將測(cè)序后的ORF5用帶有酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增，再克隆進(jìn)pMD18—T載體。經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定后，再亞克隆到“自殺性”DNA疫苗載體pSMART2a上。菌落PCR和酶切鑒定證明重組質(zhì)粒pSMART—ORF5包含完整的ORF5基因，成功構(gòu)建PRRSV自殺性DNA

4、疫苗。 將凍干的菌蛻重懸于含質(zhì)粒pSMART—ORF5的PBS緩沖液中。用PBS洗滌沉淀5次，分別測(cè)定五次上清的OD260，以確定裝入菌蛻的pDNA量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：孵育10min已足夠，延長裝載時(shí)間(至3h)，不會(huì)增加裝載量。最后裝入菌蛻的量約為最初投入量的12％。 在PCR擴(kuò)增及TA克隆后，將編碼N端缺失30個(gè)氨基酸殘基的tORF5(truncated ORF5)序列亞克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pRSETA上。誘導(dǎo)后，tORF5

5、在大腸桿菌BL21里的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過SDS—PAGE分析，證實(shí)為tGP5與6聯(lián)組氨酸(6×His)的融合蛋白，分子量約為23kDa，表達(dá)量占菌體總蛋白的15％，主要以包涵體形式存在。 用自殺性DNA疫苗及菌蛻復(fù)合疫苗注射的小鼠后，用間接ELISA方法測(cè)定其血清里的抗體水平。試驗(yàn)結(jié)果初步說明相比PRRSV自殺性DNA疫苗，PRRSV自殺性DNA菌蛻復(fù)合疫苗可以刺激機(jī)體產(chǎn)生更為有效的體液免疫反應(yīng)。并且相比肌肉注射PRRSV自殺性DNA