豬繁殖與呼吸綜合征病毒DNA疫苗的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的傳染病.該研究在擴(kuò)增、克隆了豬γ-干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、泛素及PRRSV GP5基因的基礎(chǔ)上,構(gòu)建出真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-IFN-γ、pcDNA-IL-2及單獨(dú)表達(dá)PRRSV GP5的pCI-GP

2、5質(zhì)粒、融合表達(dá)泛素與GP5的pcDNA-U-GP5質(zhì)粒,并在小鼠進(jìn)行了重組質(zhì)粒的免疫試驗(yàn).將pCI-GP5分別與pcDNA-IFN-γ、pcDNA-IL-2及pcDNA-IL-4聯(lián)合免疫SPF豬,對(duì)體液免疫、細(xì)胞免疫以及攻毒保護(hù)性進(jìn)行了檢測(cè).用RT-PCR方法從長(zhǎng)白豬脾臟淋巴細(xì)胞及肌肉組織中擴(kuò)增并克隆了豬IFN-γ基因、IL-2基因及泛素基因,并構(gòu)建出真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-IFN-γ和pcDNA-IL-2.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS7

3、細(xì)胞并對(duì)轉(zhuǎn)染上清進(jìn)行生物學(xué)活性檢測(cè),結(jié)果表明,pcDNA-IFN-γ的轉(zhuǎn)染上清可抑制PRRSV的增殖,pcDNA-IL-2的轉(zhuǎn)染上清中IL-2的效價(jià)可達(dá)24U/mL.擴(kuò)增并克隆了PRRSV GP5基因,構(gòu)建出單獨(dú)表達(dá)GP5的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pCI-GP5;將泛素基因與PRRSV GP5蛋白成熟肽編碼區(qū)融合后構(gòu)建出真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-U-GP5.將pCI-GP5及pcDNA-U-GP5分別轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞,間接免疫熒光試驗(yàn)表明pC

4、I-GP5可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上表達(dá)目的蛋白.由于泛素可加速GP5蛋白的降解,所以在pcDNA-U-GP5轉(zhuǎn)染細(xì)胞上沒(méi)有檢測(cè)到GP5的表達(dá).將pCI-GP5和pcDNA-U-GP5分別免疫Balb/c小鼠,共免疫3次,檢測(cè)小鼠的ELISA抗體水平、淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、NK細(xì)胞殺傷活性及脾臟淋巴細(xì)胞亞群的比例.結(jié)果顯示,兩種質(zhì)粒免疫后均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫;三免后5周,pCI-GP5誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平及NK細(xì)胞活性明顯高于pcDNA

5、-U-GP5;而pcDNA-U-GP5誘導(dǎo)產(chǎn)生的淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)及CD4<'->CD8<'+>T淋巴細(xì)胞比例明顯高于pCI-GP5,表明泛素與GP5的融合表達(dá)可增強(qiáng)特異性細(xì)胞免疫.將pCI-GP5分別與pcDNA-IFN-γ、pcDNA-IL-2及pcDNA-IL-4聯(lián)合免疫SPF豬,間隔2周連續(xù)免疫3次,并于三免后2周鼻內(nèi)人工感染PRRSV BJ-4.對(duì)免疫豬的ELISA抗體、中和抗體、淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、NK細(xì)胞殺傷活性及外周血淋巴細(xì)

6、胞亞群進(jìn)行了測(cè)定,并對(duì)攻毒后病毒血癥的出現(xiàn)以及病毒在組織中的分布進(jìn)行了檢測(cè).結(jié)果顯示,pCI-GP5可誘導(dǎo)免疫豬產(chǎn)生中和抗體,效價(jià)達(dá)1:19.2,并可誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫,攻毒后組織中PRRSV核酸的檢出率下降39﹪,表明表達(dá)PRRSV GP5的DNA重組質(zhì)?？蓪?duì)豬提供一定的保護(hù)力.pcDNA-IL-4與pCI-GP5共免中可將中和抗體效價(jià)提高到1:35.5,且可誘導(dǎo)以淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)及CD4<'->CD8<'+>T淋巴細(xì)胞的比例顯著