豬繁殖與呼吸綜合征病毒入胞信號(hào)傳導(dǎo)分子機(jī)制研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是一種有囊膜的正鏈RNA病毒。它屬于動(dòng)脈炎病毒科，尼多病毒目。PRRSV感染能夠?qū)е伦胸i、育肥豬急性呼吸困難，妊娠母豬繁殖障礙，給全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。盡管多年以來人們對(duì)PRRSV致病機(jī)理進(jìn)行了深入的研究，并發(fā)現(xiàn)了許多有重要意義的成果，但是這些研究主要針對(duì)于PRRSV引起宿主免疫反應(yīng)的機(jī)制。我們對(duì)于PRRSV的增殖機(jī)制如病毒的復(fù)制，入胞，組裝，釋放機(jī)制了解的還很有限。本研究主要針對(duì)PRRSV

2、入胞過程中誘導(dǎo)細(xì)胞激活的信號(hào)通路及其分子機(jī)制進(jìn)行了深入探討，系統(tǒng)分析了PRRSV入胞的分子機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容包括:
　　1 FAK-PI3K-AKT-Rac1信號(hào)通路參與PRRSV入胞過程
　　運(yùn)用Western Blot技術(shù)，激光共聚焦技術(shù)，熒光定量PCR技術(shù)我們對(duì)PRRSV(JXA1)株在進(jìn)入MARC-145細(xì)胞及PAM細(xì)胞過程中激活的信號(hào)分子進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，PRRSV在進(jìn)入細(xì)胞過程中可以激活FAK，PI3K，AK

3、T，Rac1信號(hào)分子，并且可以重構(gòu)細(xì)胞微絲骨架，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生片狀偽足。我們利用信號(hào)分子的特異性抑制劑來驗(yàn)證它們?cè)谛盘?hào)通路中的上下游關(guān)系，F(xiàn)AK的特異性抑制劑PF573228可以抑制PI3K，AKT, Rac1信號(hào)分子激活，PI3K的特異性抑制劑LY294002可以抑制AKT與Rac1激活。對(duì)細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Rac1持續(xù)性激活表達(dá)質(zhì)粒可以拮抗AKT抑制劑對(duì)病毒入胞的影響。進(jìn)一步研究表明FAK，PI3K，AKT, Rac1的特異性抑制劑都可以抑

4、制病毒入胞。所以我們的實(shí)驗(yàn)證明了病毒的入胞過程會(huì)激活FAK-PI3K-AKT-Rac1信號(hào)通路，并且PRRSV入胞過程需FAK-PI3K-AKT-Rac1信號(hào)通路激活。
　　2、整合素αV亞基可以將信號(hào)傳遞給FAK-PI3K-AKT-Rac1信號(hào)通路
　　我們對(duì)PRRSV進(jìn)入MARC-145細(xì)胞過程中整合素亞基的分布，及作用進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，PRRSV在進(jìn)入細(xì)胞過程中可以使整合素αV亞基進(jìn)行重新分布，并且病毒粒子在入胞過

5、程中與αV亞基共定位。在病毒入胞過程中無法與整合素β1亞基共定位，也無法使β1亞基進(jìn)行重新分布。所以整合素αV亞基在病毒入胞過程中可能會(huì)起作用。通過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，整合素αV亞基中和抗體可以抑制病毒入胞，用RNA干擾技術(shù)特異性干擾整合素αV亞基以后病毒入胞水平降低。為驗(yàn)證整合素αV亞基在信號(hào)通路傳導(dǎo)中的作用，我們利用αV亞基中和抗體和RNA干擾來處理細(xì)胞，結(jié)果表明抑制αV亞基的功能可以顯著抑制FAK-PI3K-AKT-Rac1信號(hào)通路。在

6、干擾αV亞基以后補(bǔ)加下游信號(hào)分子PI3K的激活劑可以使病毒入胞水平回升。而整合素的激活劑Mn2+可以促進(jìn)病毒粒子入胞，并且可以促進(jìn)信號(hào)通路激活。為驗(yàn)證脂筏在αV亞基傳導(dǎo)信號(hào)過程中的作用，利用激光共聚焦等方法我們發(fā)現(xiàn)，在PRRSV入胞過程中整合素αV亞基會(huì)轉(zhuǎn)移到脂筏中，并且脂筏的完整性對(duì)于信號(hào)通路的傳導(dǎo)都是必須的。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在病毒入胞過程中，整合素αV亞基可以脂筏中將信號(hào)傳遞給FAK-PI3K-AKT-Rac1信號(hào)通路，從而促進(jìn)病毒

7、入胞。
　　3、細(xì)胞內(nèi)ROS、Ca2+參與PRRSV入胞和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程
　　運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)等方法我們對(duì)PRRSV（JXA1株）在進(jìn)入MARC-145細(xì)胞過程中激活的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧(ROS)進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明，PRRSV（JXA1株）在進(jìn)入細(xì)胞過程中可以刺激細(xì)胞產(chǎn)生ROS。通過Western Blot技術(shù)，熒光定量PCR技術(shù)，我們對(duì)ROS的作用進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，ROS的特異性清除劑NAC可以抑制病毒入胞，另外NAC

8、可以抑制病毒在入胞過程中激活的FAK-PI3K-AKT-Rac1信號(hào)通路。TLR4的特異性抑制劑TAK242可以抑制由病毒入胞誘導(dǎo)的ROS，并且TAK242同樣可以抑制病毒入胞與信號(hào)通路激活。除此之外，細(xì)胞內(nèi)Ca>的螯合劑BAPTA-AM也能夠抑制PRRSV入胞與信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞內(nèi)的ROS與Ca2+參與病毒入胞與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。
　　4、PRRSV可能通過結(jié)構(gòu)蛋白GP3上的RHD基序與整合素結(jié)合
　　整合素需要通