豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抑制RNA誘導(dǎo)的基因沉默.pdf

1、RNA干擾(RNA interference，RNAi)現(xiàn)象是一種由雙鏈RNA(double-strand RNA，dsRNA)啟動(dòng)的序列特異性基因沉默機(jī)制。RNAi從線蟲到人類細(xì)胞都廣泛存在，是一種先天性抗病毒的自我防御方式，能夠抵抗外源基因或病毒的入侵。然而，病毒在受到RNAi抵抗過(guò)程中會(huì)通過(guò)病毒蛋白或非編碼的病毒RNA來(lái)抑制RNA沉默，即RNA沉默抑制子(RNA silencing suppressor，RSS)，從而使病毒在宿主

2、細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、增殖，促進(jìn)病毒感染。目前，已從植物、動(dòng)物和人類病毒中鑒定了20多種RSSs，并且這些RSSs中大部分都是干擾素的拮抗蛋白。
　　豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸困難為主要特征的病毒性疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRS是由PRRSV引起的，PRRSV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于動(dòng)脈炎病毒屬

3、(Arterivirus)，動(dòng)脈炎病毒科，套式病毒目(Nidoviruses)?；蚪M全長(zhǎng)約15kb，含有9個(gè)開放性閱讀框(ORFs)，其中，ORF-1編碼14中非結(jié)構(gòu)蛋白(nsps)，nsps除了具有復(fù)制、蛋白酶、聚合酶的功能外，同時(shí)還能抑制干擾素的產(chǎn)生;ORF2-7編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。
　　RNAi作為宿主細(xì)胞抑制病毒復(fù)制、清除病毒的一種先天性免疫機(jī)制，是宿主重要的免疫防御系統(tǒng)，許多持續(xù)性感染的病毒都存在一定的機(jī)制拮抗RNA誘

4、導(dǎo)的基因沉默。PRRSV存在免疫抑制和持續(xù)性感染的免疫學(xué)特性，并且PRRSV的感染能抑制干擾素的產(chǎn)生，表明PRRSV可能會(huì)存在抑制RNA誘導(dǎo)的基因沉默的作用，從而逃避宿主先天性的抗病毒免疫。
　　本研究利用RNAi技術(shù)，將人工合成的dsRNA和shRNA、mi-RNA干擾表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞，dsRNA、shRNA和mi-RNA靶向的目標(biāo)基因是螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因(Luciferase，Luc)，經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告

5、檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)dsRNA、shRNA和mi-RNA均抑制了轉(zhuǎn)染的細(xì)胞Luc的表達(dá)量，表明在MARC-145細(xì)胞上成功構(gòu)建了dsRNA、shRNA和mi-RNA誘導(dǎo)的基因沉默的模型;PRRSV與RNAi模型共作用于MARC-145細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PRRSV能夠恢復(fù)被抑制的Luc的表達(dá)量，證實(shí)PRRSV能夠抑制RNA誘導(dǎo)的基因沉默;PRRSV的nsp1和nsp11分別與RNAi模型共轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞，nsp1和nsp11同樣也能恢復(fù)被

6、抑制的Luc的表達(dá)量，其中，nsp1可以自水解為nsp1α和nsp1β，nsp1能夠恢復(fù)被抑制基因表達(dá)量主要是通過(guò)nsp1α實(shí)現(xiàn)的，nsp1α和nsp11可能是RNA沉默抑制子;分別構(gòu)建nsp1α和nsp11的突變體使nsp1α的木瓜蛋白酶活性和nsp11的核酸內(nèi)切酶活性都失活，nsp1α和nsp11的突變體分別與RNAi模型共轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞，然而，這些突變體不能抑制RNAi誘導(dǎo)的基因沉默，這揭示nsp1α的木瓜蛋白酶活性和n