豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp10基因的克隆及表達(dá)研究.pdf

1、[目的]：建立一種能區(qū)分PRRS滅活疫苗免疫豬群和野毒隱性感染豬群的PRRS血清抗體ELISA檢測方法，為PRSS的臨床診斷與預(yù)防控制提供參考依據(jù)。
　　[方法]：針對PRRSVNsp10基因合成特異性引物，采用RT-PCR方法對本實驗室保存的PRRSVJL分離株核酸提取物進(jìn)行擴(kuò)增，回收純化PCR產(chǎn)物，克隆至pMD18-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-Nsp10，將PCR和酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序分析。
　　采

2、用雙酶切方法獲取目的基因片段，插入原核表達(dá)載體pET-32a上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)不同誘導(dǎo)時間和不同IPTG濃度優(yōu)化后，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Western-Blotting檢測。
　　采用His·BindPurificationKit對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，用作包被抗原，進(jìn)行各種反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立一種基于PRRSVNsp10蛋白的間接ELISA方法，并與現(xiàn)行使用的基于N蛋白抗體ELISA檢測試劑盒進(jìn)行

3、比較。
　　[結(jié)果]：RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果可見一條與預(yù)期大小(717bp)相一致的DNA條帶；將目的基因連接至pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，可觀察到大小約為2600bp的載體帶和717bp的目的帶；取陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行測序顯示，Nsp10基因cDNA全長為699bp，可編碼233個氨基酸。
　　應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析結(jié)果表明，PRRSVJL株Nsp10基因與PRRSV早期分離株的核苷酸同源性

4、為91.7％～94.0％，氨基酸同源性為97.4％～98.7％；與新近流行毒株的核苷酸同源性為98.3％～98.6％，氨基酸同源性為99.6％～100％。編碼的Nsp10蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)，含許多抗原指數(shù)較高的區(qū)域、親水區(qū)域和表面可及性區(qū)域，含有9個潛在的抗原決定簇，具備形成抗原表位的良好條件。
　　將Nsp10基因克隆至表達(dá)載體pET-32上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果顯示，在43.4KDa處可見到明顯的目的蛋白帶，最

5、佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件是：誘導(dǎo)表達(dá)時間4h，IPTG誘導(dǎo)濃度0.2mmol/L；目的基因的表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western-Blotting檢測，結(jié)果顯示重組蛋白可被PRRSV陽性血清所識別。采用尿素溶解、His·BindPurificationKit純化后，可得到較純的Nsp10重組蛋白；取重組蛋白作為包被抗原，建立ELISA方法，結(jié)果顯示其最佳反應(yīng)條件是：重組蛋白包被濃度為7.37μg/mL，血清稀釋度為1:40

6、，封閉液和血清稀釋液以5％脫脂乳為佳，酶標(biāo)二抗稀釋度為1:1000，陰陽性血清臨界值為0.32。
　　應(yīng)用本次建立的ELISA方法對豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟、豬偽狂犬病、豬乙型腦炎、豬口蹄疫及豬圓環(huán)病毒感染等陰、陽性血清進(jìn)行檢測顯示，只有豬繁殖與呼吸綜合征陽性血清OD450值≥0.32，而其它血清樣本OD450值均小于0.32；對3份PRRS陽性血清和1份陰性血清進(jìn)行5次重復(fù)檢測，其變異系數(shù)為2.5％～7.1％；對不同稀釋度的陽性

7、血清樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果稀釋度為1:800的血清樣本仍為陽性。
　　與N蛋白抗體ELISA檢測試劑盒的檢測結(jié)果參照顯示，對于90份PRRS滅活疫苗免疫豬血清樣本，用本試驗建立的ELISA方法檢測抗體陽性率為2.22％(2/90)，基于N蛋白檢測試劑盒檢測的血清抗體陽性率為27.77％(25/90)，兩者檢測結(jié)果差異較大；對于113份未免豬血清樣本，本試驗建立的ELISA方法檢測血清抗體陽性率為22.12％(25/113)，基于N蛋白

8、檢測試劑盒檢測結(jié)果為25.66％(29/113)，差異不明顯。
　　[結(jié)論]：
　　(1)成功克隆出PRRSV貴州JL株的Nsp10基因，經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析顯示該基因編碼的Nsp10蛋白具有良好的抗原性。
　　(2)成功構(gòu)建了PRRSVJL株Nsp10基因的pET-32a原核表達(dá)載體并在大腸桿菌中得到了有效的表達(dá)。
　　(3)成功建立了基于PRRSVNsp10蛋白抗體的間接ELISA檢測方法，該方法具有較好的特