豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp10的結(jié)構(gòu)與功能解析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的以懷孕母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀為特征的一種傳染病。PRRSV有兩個(gè)血清型：歐洲型和北美型。其代表株分別被命名為Lelystad Virus和VR-2332。關(guān)于PRRSV病毒基因組RNA的復(fù)制、亞基因組mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白的翻譯、病毒顆粒組裝以及病毒致病機(jī)理等許多問題

2、沒有解決.尤其是在2006年全國大范圍內(nèi)爆發(fā)的“豬高熱綜合癥”之后，作為主要病原的高致病性（HighPathogenicity，HP）PRRSV的致病機(jī)理成為了研究熱點(diǎn)。PRRSV Nsp10由N端的鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域（zinc-binding domain，ZBD）和C端的超家族1（superfamily1，SF1）解螺旋酶（helicase，Hel）區(qū)域組成，具有ATP酶（ATPase）和解旋酶活性，在病毒基因組及亞基因組合成過程中起到重

3、要作用。本研究旨在利用北美型和歐洲型PRRSV感染性克隆解析非結(jié)構(gòu)蛋白10（Nsp10）的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，為進(jìn)一步剖析病毒遺傳組份的結(jié)構(gòu)與功能及其致病機(jī)理奠定基礎(chǔ).現(xiàn)將研究內(nèi)容簡述如下：
　　 1.利用反向遺傳操作解析PRRSV Nsp10 ZBD的結(jié)構(gòu)與功能
　　 PRRSV Nsp10 N端的鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ZBD）主要由多個(gè)保守的半胱氨酸（Cys）和組氨酸（His）組成，與Zn2+結(jié)合形成鋅指結(jié)構(gòu)。為研究ZBD結(jié)構(gòu)

4、與功能的關(guān)系，本研究先通過SMART軟件預(yù)測了Nsp10的鋅指結(jié)構(gòu)。接著在感染性克隆的基礎(chǔ)上，利用點(diǎn)突變PCR對PRRSV Nsp10ZBD編碼的多個(gè)氨基酸（特別是保守的Cys和His）進(jìn)行突變，構(gòu)建了19個(gè)突變克隆，通過DNA轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，研究PRRSVNsp10ZBD結(jié)構(gòu)的改變對病毒基因組的復(fù)制、亞基因組的轉(zhuǎn)錄以及感染性的影響。結(jié)果表明，4個(gè)突變體（pMHZM5、pMHH28C、pMHS55P、pMHS55A）拯救出病毒

5、，且突變病毒具有遺傳穩(wěn)定性，其生長過程與親本病毒相似，但滴度均比親本病毒低（特別是vMHH28C），且突變病毒形成的空斑比親本病毒?。╲MHS55P除外），說明第28位His被Cys替換后，并不影響鋅指結(jié)構(gòu)的形成，但卻造成了病毒滴度的降低，第5位精氨酸（Arg）以及第55位絲氨酸（Ser）可能不參與ZBD的功能，從而不影響病毒基因組的復(fù)制，后者可能位于鉸鏈區(qū)，充當(dāng)將ZBD與Nsp10剩余部分相連接的作用；其余15個(gè)突變體均未拯救出病毒，

6、說明突變的氨基酸影響了鋅指結(jié)構(gòu)的形成，從而影響了病毒的感染性，其中突變體pMHH43C被檢測到N蛋白的表達(dá)，但表達(dá)量很低，說明第43位His被Cys替換后并不影響病毒亞基因組的轉(zhuǎn)錄過程，推測可能影響了病毒粒子的形成，其余14個(gè)突變體均未被檢測到N蛋白的表達(dá)及亞基因組7的合成，說明保守的Cys和His對病毒基因組的復(fù)制及亞基因組的轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要，可能13個(gè)保守的Cys和His都參與與Zn2+的結(jié)合。本研究還利用真核載體表達(dá)親本PRRSVNs

7、p10，對一些致死突變體進(jìn)行反式互補(bǔ)，結(jié)果表明這些致死突變體均不能被反式互補(bǔ)，說明利用真核載體表達(dá)的親本PRRSV Nsp10可能無法成為PRRSV復(fù)制酶多聚蛋白的一部分，從而不能發(fā)揮Nsp10的功能，推測ZBD在PRRSV Nsp10中可能起到順式（in cis）調(diào)控的功能，對病毒基因組的復(fù)制、亞基因組的轉(zhuǎn)錄以及病毒粒子包裝都極其重要。
　　 2.利用反向遺傳操作解析PRRSV Nsp10解螺旋酶的結(jié)構(gòu)與功能
　　 P

8、RRSV Nsp10解螺旋酶由7個(gè)保守的基序（motif）組成，推測這些基序?qū)饴菪傅墓δ芷鸬街匾饔谩檠芯縋RRSV Nsp10解螺旋酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，本研究利用點(diǎn)突變PCR對歐洲型PRRSV全長感染性克隆Nsp10解螺旋酶基序Ⅰ和Ⅱ編碼的多個(gè)保守的氨基酸和非保守氨基酸進(jìn)行突變，構(gòu)建了一系列突變克隆，通過DNA轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，研究PRRSVNsp10解螺旋酶基序的改變對病毒基因組的復(fù)制、亞基因組的轉(zhuǎn)錄以及感染性的影響。

9、結(jié)果表明，兩個(gè)突變體（pMHY223F和pMHD225E）拯救出病毒，其生長過程與親本病毒相似，但滴度均比親本病毒低，突變病毒vMHY223F形成的空斑形態(tài)與親本病毒相似，但突變病毒vMHD225E形成的空斑比親本病毒小，說明第223位非保守的極性絡(luò)氨酸（Tyr）突變成非極性的苯丙氨酸（Phe）以及第225位保守的天冬氨酸（Asp）突變成同為酸性的谷氨酸（Glu）對病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄幾乎沒有影響；其余突變體（pMHS153A，pMHK15

10、5R，pMHE226D）均未拯救出病毒，前者pMHS153A被檢測到N蛋白的表達(dá)，但表達(dá)量很低，說明第153位非保守的絲氨酸（Ser）被丙氨酸（Ala）替換后并不影響病毒亞基因組的轉(zhuǎn)錄過程，推測可能影響了病毒粒子的形成；后兩者（pMHK155R，pMHE226D）均未被檢測到N蛋白的表達(dá)及亞基因組7的合成，說明保守的第155位賴氨酸（Lys）和第226位Glu分別對基序Ⅰ和Ⅱ的功能起重要作用，且突變基序Ⅰ和Ⅱ中保守氨基酸對病毒造成的損傷

11、比突變非保守氨基酸大，這也進(jìn)一步證明了基序Ⅰ和Ⅱ?qū)饴菪腹δ艿闹匾?；而且這些致死突變體均不能被反式互補(bǔ)，推測解螺旋酶在PRRSVNsp10中可能起到順式（in cis）調(diào)控的功能，在病毒基因組的復(fù)制、亞基因組的轉(zhuǎn)錄以及病毒粒子包裝過程中扮演著極其重要的角色。
　　 3.兩型PRRSV Nsp10嵌合克隆的構(gòu)建
　　 兩型PRRSV Nsp10的核酸同源性為53.9％，但它們有著相似的ZBD和解螺旋酶，推測它們具有相似

12、的功能。為了研究結(jié)構(gòu)相似的Nsp10是否功能一致，本研究以北美型經(jīng)典弱毒株感染性克?。╬APRRS）為主要骨架，利用合適的酶切位點(diǎn)和SOE PCR技術(shù)將其Nsp10替換為歐洲型弱毒株感染性克?。╬MSHE）Nsp10，從而構(gòu)建了兩型PRRSVNsp10嵌合克隆pCHN10。經(jīng)DNA轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞后未能拯救出病毒，也未被檢測到亞基因組7的合成及N蛋白和Nsp2的表達(dá)。結(jié)果表明，歐洲型PRRSVNsp10不能替代北美型PRRS V