豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp4蛋白抗體制備與免疫抑制作用觀察.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是目前引起世界養(yǎng)豬業(yè)嚴重經(jīng)濟損失的最重要病原之一，但病毒感染和致病機制尚不十分清楚。PRRSV基因組編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白和14個非結(jié)構(gòu)蛋白(Nsps)，其中，Nsp4具有絲氨酸蛋白酶活性，負責Nsp3-Nsp12的加工和切割，在PRRSV侵染宿主和復制過程中具有重要作用。本研究采用大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得純化Nsp4和Nsp12蛋白，免疫小鼠后制備獲得特異性多克隆抗體。同時，通過構(gòu)建PRRSV不同毒力毒株Ns

2、ps真核表達質(zhì)粒，測定其抑制IFN-β啟動子活性作用;構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄因子IRF3真核表達質(zhì)粒，從IRF3支路分析觀察Nsp4對IFN-β啟動子活性的影響，證明Nsps對IFN-β沒有抑制作用，為闡明PRRSV免疫抑制作用奠定了基礎。具體研究包括:
　　1.PRRSV Nsp4和Nsp12抗體制備與鑒定
　　本研究將PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp4基因和Nsp12基因分別克隆至原核表達載體pET32a(+)和pGEX-6P-1，轉(zhuǎn)化至

3、BL21以IPTG誘導表達，SDS-PAGE和Western-blot鑒定結(jié)果顯示，Nsp4和Nsp12分別以可溶性蛋白和包涵體形式表達，大小分別為42ku和44ku，均具有良好的反應原性。經(jīng)過Ni-NTA鎳離子親和層析和包涵體洗液純化，獲得純化重組蛋白，分別免疫BALB/c小鼠制備抗血清，Western-blot和IFA結(jié)果顯示，制備的抗血清均與PRRSV發(fā)生特異性反應，ELISA效價達到1∶32000。該抗體可用于PRRSV Nsp

4、4和Nsp12生物學功能研究。
　　2.PRRSV Nsp4對IFN-β啟動子活性的影響
　　有研究報道，PRRSV Nsp1、Nsp2、Nsp4和Nsp11有抑制Ⅰ型干擾素的活性，其中，Nsp1、Nsp2和Nsp11抑制Ⅰ型干擾素的機制研究較多，而Nsp4抑制Ⅰ型干擾素作用尚未有詳細研究。本研究首先采用pEGFP-N1表達質(zhì)粒，構(gòu)建PRRSV NT0801毒株10個Nsp的重組表達質(zhì)粒pEGFP-NTNsps，轉(zhuǎn)染BHK2

5、1和Hela細胞，熒光顯微鏡觀察和Westernblot結(jié)果證明其均獲得表達。然后采用IFN-β啟動子活性雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測方法，將pEGFP-NTNsps轉(zhuǎn)染Hela細胞后，在poly(I∶C)刺激下，Nsp1、Nsp2和Nsp11蛋白能顯著抑制IFN-β啟動子活性(P＜0.001)，但Nsp4對IFN-β啟動子活性沒有影響;再用pcDNA3.1載體構(gòu)建表達強毒株BB0907、中毒株NT0801和弱毒株S1的Nsp4，Wste