豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp4調(diào)控IFN-β的分子機制研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種病毒性傳染病，給全球的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟影響。該病主要臨床癥狀為引起妊娠母豬嚴重的繁殖障礙以及各年齡段豬的呼吸系統(tǒng)疾病。PRRSV能夠通過許多途徑逃避宿主的天然免疫，抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。病毒的一些非結(jié)構(gòu)蛋白在抑制干擾素產(chǎn)生的過程中都起到了重要作用。Nsp4是一種3C樣絲氨酸蛋白酶(3CLSP)，能夠水解多聚蛋白pp1a/pp1ab產(chǎn)生Nsp3～Nsp1

2、2十種成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白，但目前PRRSV Nsp4抑制Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的分子機制尚不清楚。
　　本研究證實了PRRSV Nsp4作為一種多功能的蛋白能夠通過切割接頭分子MAVS和NEMO阻礙Ⅰ型干擾素的表達。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV Nsp4切割MAVS依賴于其本身的蛋白酶活性，而不依賴細胞凋亡途徑和蛋白酶體途徑的方式。PRRSV的蛋白水解酶切割MAVS和NEMO也揭示了PRRSV調(diào)節(jié)天然免疫的新機制。主要的研究內(nèi)容如下:

3、　　1.PRRSV Nsp4通過阻礙IRF3和NF-κB的活化抑制RIG-I/MDA5介導(dǎo)的IFN-β的激活通過熒光素酶報告系統(tǒng)證實PRRSV Nsp4能夠抑制小鼠仙臺病毒(SEV)誘導(dǎo)IFN-β的表達。之后我們進一步證實PRRSV Nsp4通過阻礙IRF3和NF-κB的活化抑制RIG-I/MDA5介導(dǎo)的IFN-β的激活，且PRRSV Nsp4抑制IFN-β的產(chǎn)生呈劑量依賴性和酶活性依賴性。
　　2.PRRSV Nsp4通過切割M

4、AVS和NEMO抑制IFN-p的產(chǎn)生Usp4是PRRSV主要的蛋白水解酶，在病毒的復(fù)制過程中起著重要作用，而PRRSV Nsp4抑制IFN-β的產(chǎn)生也呈現(xiàn)出酶活性依賴性。為了研究PRRSV Nsp4是否通過與RIG-I信號通路中的接頭分子相互作用來抑制IFN-β的產(chǎn)生，將MAVS或NEMO真核表達質(zhì)粒與Nsp4真核表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞，通過western-blot檢測發(fā)現(xiàn)PRRSV Nsp4能夠同時切割信號分子MAVS和N

5、EMO，且呈酶活性依賴性。之后我們對PRRSV Nsp4切割MAVS做了進一步研究，發(fā)現(xiàn)Nsp4切割MAVS依賴于其自身的蛋白酶活性，而不依賴細胞凋亡及蛋白酶體途徑。
　　3.PRRSV Nsp4切割MAVS位點的確定研究表明，PRRSV Nsp4底物的酶切位點有一定的特異性，即PRRSV Nsp4通過識別底物Glu-Gly、 Glu-Ala或Glu-Ser殘基位點特異性切割底物。為了確定PRRSVNsp4切割MAVS的位點，通過

6、定點突變構(gòu)建了MAVS的突變體真核表達質(zhì)粒(MAVS-E268A、MAVS-E274A、MAVS-E288A)，與Nsp4真核表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T后，通過western blot檢測發(fā)現(xiàn)PRRSV Nsp4不能切割MAVS-E268A突變體，說明PRRSV Nsp4通過識別MAVS第268位谷氨酸切割MAVS。與全長的MAVS相比，切割MAVS產(chǎn)生的兩個片段(1-268和269-540)都不能夠有效的誘導(dǎo)IFN-β的表達。