豬繁殖與呼吸綜合征重組腺病毒疫苗免疫候選分子研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的豬的一種高度傳染病，又稱“豬藍(lán)耳病”，本病以妊娠母豬的繁殖障礙(后期流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱胎)及各種年齡豬特別是仔豬的呼吸道疾病(間質(zhì)性肺炎)為特征。本病給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，現(xiàn)已成為危害規(guī)?；B(yǎng)豬生產(chǎn)的主要疫病之一。目前，已有商品化的弱毒疫苗和滅活苗用于PRRS的防制，但由于其自身的缺陷而不能提供有效的免疫保護(hù).PRRSV屬于尼多病毒目動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬

2、成員，為有囊膜、單股正鏈RNA病毒，其致病機(jī)理和免疫特性尚不十分清楚。 本研究設(shè)計(jì)構(gòu)建了表達(dá)PRRSV膜相關(guān)蛋白GP3、GP4、GP5和M蛋白的重組腺病毒，通過小鼠免疫試驗(yàn)篩選了PRRSV重組腺病毒免疫候選分子，為PRRSV基因工程疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。 1．PRRSV CTL細(xì)胞免疫檢測(cè)方法的建立 為了探討PRRSV GP3、GP4、GP5、M蛋白基因誘導(dǎo)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的能力，建立一種非放射性、簡(jiǎn)

3、便易行的檢測(cè)特異性CTL的方法，應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增得到GP3、GP4、GP5和M蛋白基因并克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-GP3、pcDNA3-GP4、pcDNA3-GP5和pcDNA3-M。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NIH3T3細(xì)胞，G418篩選克隆，經(jīng)間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)目的蛋白表達(dá)，成功培育了4株能分別表達(dá)PRRSV GP3、GP4、GP5、M蛋白的細(xì)胞株NIH3T3/GP3、NIH3T3/GP

4、4、NIH3T3/GP5和NIH3T3/M，可作為PRRSV CTL，檢測(cè)方法中的靶細(xì)胞。以NIH3T3細(xì)胞為靶細(xì)胞確定了最適靶細(xì)胞數(shù)(2×10<'5>/mL)，建立了檢測(cè)PRRSV特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的殺傷效應(yīng)的乳酸脫氫酶釋放法。 2．PRRSV M與GP5蛋白融合表達(dá)及其免疫特性研究 為了提高GP5蛋白的免疫原性，在構(gòu)建了表達(dá)GP5蛋白重組腺病毒的基礎(chǔ)上，將PRRSV的M蛋白與GP5融合表達(dá)，間接免疫熒光試驗(yàn)和We

5、stern blot證明，成功構(gòu)建了融合表達(dá)M與GP5蛋白的重組腺病毒(rAd-M-GP5)。取120只BALB/c小鼠，隨機(jī)分成5組，每組24只，將重組腺病毒rAd-GP5(表達(dá)GP5蛋白)、rAd-M(表達(dá)M蛋白)和rAd-M-GP5(表達(dá)M-GP5融合蛋白)免疫小鼠，間隔兩周加強(qiáng)免疫一次．對(duì)照組分別注射wtAd(野生型腺病毒)或PBS，觀察56天，間隔2周檢測(cè)PRRSV中和抗體，比較其細(xì)胞免疫水平，結(jié)果為：加強(qiáng)免疫后2周rAd-M

6、-GP5免疫組中和抗體滴度明顯高于rAd-GP5免疫組，抗體效價(jià)達(dá)到1：102(56dpi)。同時(shí)，免疫rAd-M-GP5的小鼠產(chǎn)生了比tad-M(28％)更高水平的PRRSV特異的CTL反應(yīng)，達(dá)到36.2％(42dpi)，而rAd-GP5產(chǎn)生的PRRSV特異的應(yīng)答較低。該結(jié)果說明，M與GP5融合后能顯著增強(qiáng)GP5蛋白誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。 3．GP3蛋白的信號(hào)肽序列和N-端疏水域?qū)P3免疫特性的影響 次要

7、結(jié)構(gòu)蛋白GP3與免疫保護(hù)有關(guān)，但是其免疫特性知之甚少。為了研究信號(hào)肽序列和N-端疏水域?qū)P3免疫特性的影響，構(gòu)建了表達(dá)缺失該區(qū)域(aa2～64)的GP3蛋白的重組腺病毒(rAd-tGP3)，并將其免疫特性與GP3進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠在加強(qiáng)免疫重組腺病毒rAd-tGP3和rAd-GP3后2周產(chǎn)生了PRRSV特異的細(xì)胞免疫應(yīng)答，包括T細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒T細(xì)胞應(yīng)答。而且，免疫rAd-tGP3的小鼠的應(yīng)答水平(中和抗體1：14、SI為4.5

8、、殺傷率為36％(56dpi))明顯高于rAd-GP3免疫組(中和抗體1：10、SI為3.3、殺傷率為28％(56dpi))．表明GP3蛋白的前64個(gè)氨基酸對(duì)GP3蛋白的構(gòu)象和抗原結(jié)構(gòu)可能有重要影響。 4．GP3和GP4蛋白對(duì)GP5蛋白的協(xié)同免疫特性研究 為了研究GP3或GP4蛋白能否協(xié)同GP5蛋白的免疫原性，分別將GP3、GP4、GP3和GP4與GP5蛋白融合表達(dá)，間接免疫熒光試驗(yàn)和western blot證明，成功構(gòu)

9、建了融合表達(dá)GP3-GP5(rAd-GP3-GP5)、GP4-GP5(rAd-GP4-GP5)以及GP3-GP4-GP5(rAd-GP3-GP4-GP5)的重組腺病毒。同時(shí)還構(gòu)建了2株重組腺病毒，分別表達(dá)單個(gè)的GP3和GP4蛋白。將重組腺病毒免疫BALB/c小鼠，間隔兩周加強(qiáng)免疫一次。對(duì)照組分別注射wtAd或PBS。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠在加強(qiáng)免疫后2周產(chǎn)生了PRRSV特異的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。然而，只有免疫rAd-GP3-GP5、rAd-GP

10、4-GP5、rAd-GP3-GP4-GP5的小鼠產(chǎn)生了高滴度的中和抗體，效價(jià)分別達(dá)到1：82、1：96、1：120(56dpi)，并誘導(dǎo)較強(qiáng)的淋巴細(xì)胞增殖。同時(shí)，相對(duì)于rAd-GP3(21.4％)和rAd-GP5(18％)免疫組，免疫rAd-GP3-GP5和rAd-GP3-GP4-GP5的小鼠產(chǎn)生了更高水平的PRRSV特異的CTL反應(yīng)，殺傷效率分別為37.5％和44.7％(42dpi)。說明GP3蛋白或GP3與GP4蛋白對(duì)GP5蛋白的體

11、液免疫和細(xì)胞免疫有協(xié)同促進(jìn)作用。 5．GP5蛋白信號(hào)肽和非中和表位對(duì)其誘導(dǎo)中和抗體應(yīng)答的影響 為了研究GP5蛋白的信號(hào)肽和非中和表位對(duì)其誘導(dǎo)中和抗體的影響，構(gòu)建了表達(dá)缺失非中和表位(A)和/或信號(hào)肽序列的GP5蛋白的3個(gè)重組腺病毒，利用BALB/c小鼠評(píng)估它們誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的特性。即：表達(dá)缺失非中和表位(aa27-31)的GP5(rAd-GP5△27/31)、表達(dá)缺失A表位及A表位與中和表位(B)中間的序列(aa27-

12、36)的GP5(rAd-GP5△27/36)、以及表達(dá)缺失B表位之前的序列(包括信號(hào)肽，aa2-36)的突變體(rAd-GP5△2/36)。結(jié)果為：3株重組體接種小鼠后均產(chǎn)生了明顯的抗PRRSV抗體的應(yīng)答和明顯的中和抗體，其滴度達(dá)到1：30、1：19、1：14(56dpi)，明顯高于表達(dá)野生型GP5的重組腺病毒rAd-GP5誘導(dǎo)的中和抗體(1：8)．表明去除GP5蛋白A表位能提高其誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，而且，信號(hào)肽序列及A表位周圍的序列能影

13、響中和抗體的產(chǎn)生水平。 6．GP5蛋白N-糖基對(duì)其誘導(dǎo)中和抗體應(yīng)答的影響 對(duì)于一些病毒來說，如HIV、SIV和HBV，“糖基屏蔽效應(yīng)”可能是病毒逃避中和免疫應(yīng)答的一個(gè)主要機(jī)理，使得病毒在體內(nèi)持續(xù)感染。PRRSV GP5蛋白含有4個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別位于N30、N33、N44、N51。為了研究各位點(diǎn)的糖基對(duì)GP5蛋白免疫特性的影響，本研究共構(gòu)建了6個(gè)重組腺病毒，分別為表達(dá)野生型的GP5以及突變1-4個(gè)糖基化位點(diǎn)的突變體： r

14、Ad-GP5(wtGP5)、 rAd-GP5N44S(N44S)、rAd-GP5N44/51S(N44/51S) 、 rAd-GP5N30/N44/51S(N30/44/51S) 、rAd-GP5N30/N33/N44/51S(N30/33/44/51S)和rAd-GP5N30/N33S(N30/33S)。小鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果為：5株表達(dá)GP5糖基化位點(diǎn)突變的重組體均可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的抗PRRSVELISA抗體，中和抗體水平明顯高于野生型

15、GP5重組腺病毒，說明，4個(gè)糖基化位點(diǎn)都能影響到GP5蛋白誘導(dǎo)中和抗體的能力。而且，rAd-GP5N30/N33s誘導(dǎo)的中和抗體滴度高于rAd-GP5N44S、 rAd-GP5N44/51S、 rAd-GP5N30/N44/51S，而低于rAd-GP5N30/N33/N44/51S，由于N30和N33殘基上的糖基靠近GP5蛋白的非中和表位(aa27～30)，說明N30和N33這2個(gè)位點(diǎn)對(duì)誘導(dǎo)中和抗體非常重要．此外，野生型GP5和糖基化位

16、點(diǎn)突變體誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答沒有明顯的差異，說明，4個(gè)糖基化位點(diǎn)對(duì)GP5蛋白細(xì)胞免疫特性無明顯影響。 綜上所述，PRRSV M與GP5、GP3與GP5、GP3和GP4與GP5蛋白融合表達(dá)后，能明顯提高其誘導(dǎo)的中和抗體水平和細(xì)胞免疫應(yīng)答；GP5蛋白的糖基化位點(diǎn)和非中和表位能明顯影響其誘導(dǎo)中和抗體的能力；GP3蛋白具有較強(qiáng)的細(xì)胞免疫特性，從而為PRRSV重組腺病毒疫苗免疫候選分子設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù)，為研究安全有效的PRRSV新型疫