豬繁殖與呼吸綜合征病毒快速鑒別檢測及免疫防控技術(shù)研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratorysyndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)所致的一種高度接觸性傳染病，以母豬繁殖障礙以及各種年齡豬特別是仔豬呼吸道疾病為特征，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。臨床上，PRRSV流行毒株日益多樣化和復(fù)雜化，給PRRS的有效防控帶來很大困難。建立快速、特異的鑒別檢測方法，掌握當(dāng)前廣西PRRSV流行毒株的特點，探索有針對性的免疫防控措施，對

2、有效防控PRRS具有重要意義。
　　1.同時檢測PRRSV美洲型經(jīng)典株、變異株和TJM-F92疫苗株的多重RT-PCR方法的建立及應(yīng)用
　　為建立PRRSV的快速鑒別檢測方法，本研究針對PRRSV美洲型經(jīng)典株、高致病性變異株以及TJM-F92疫苗株的Nsp2基因序列特點，設(shè)計2對特異性引物。經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)條件后，建立了能同時檢測并區(qū)分PRRSV美洲型經(jīng)典株、變異株及疫苗株的多重RT-PCR方法。該方法特異性強，與豬的其它病毒間不

3、存在交叉反應(yīng);敏感性高，對重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢出下限為1.13×103拷貝/μL。應(yīng)用所建立的方法，對349份臨床疑似病料進(jìn)行檢測，結(jié)果檢出PRRSV陽性119份，其中美洲型經(jīng)典株5份、變異株107份，TJM-F92疫苗株7份，并且有變異株和TJM-F92疫苗株混合陽性7份。表明，本研究成功建立了PRRSV美洲型經(jīng)典株、變異株及TJM-F92疫苗株的多重RT-PCR鑒別檢測方法，可用于PRRSV的臨床檢測及流行病學(xué)調(diào)查。
　　2.廣

4、西地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp2和ORF5基因的遺傳多樣性分析
　　為了解廣西地區(qū)PRRSV流行毒株的遺傳進(jìn)化情況，對2014-2016年間來自廣西各地的部分PRRSV陽性病料進(jìn)行Nsp2和ORF5基因的擴增和測序分析。結(jié)果，獲得34個Nsp2基因序列和45個ORF5基因序列，均屬于美洲型毒株。Nsp2基因間核苷酸序列的同源性為91.8％～100％，與PRRSV美洲型毒株VR-2332、 CH-1a、 JXA1及NADC30株

5、核苷酸序列的同源性分別為81.3％～84.3％、88.9％～92.1％、94.3％～99.3％、73.5％～75.1％，而與PRRSV歐洲型毒株LV株核苷酸序列的同源性為51.5％～53.2％。ORF5基因間核苷酸序列的同源性為82.8％～100％，與PRRSV美洲型毒株VR-2332、CH-1a、JXA1及NADC30株核苷酸序列的同源性分別為83.7％～99.5％、85％～95％、83.8％～99.7％、83.2％～86.4％，而與

6、PRRSV歐洲型毒株LV株核苷酸序列的同源性為62.4％～64.5％。基于Nsp2和ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列繪制的遺傳進(jìn)化樹中，廣西地區(qū)的毒株主要分布在以JXA1為代表的Ⅳ亞群。表明，當(dāng)前廣西PRRSV流行毒株以JXA1株為代表的高致病性美洲型毒株為主，各毒株Nsp2和ORF5基因序列存在一定的差異，尚未發(fā)現(xiàn)歐洲型毒株和NADC30類美洲型毒株。
　　3.PRRSV野毒感染豬群免疫接種弱毒活疫苗的效果分析
　　為評估PR

7、RS弱毒活疫苗的免疫效果，本研究在兩個小型豬場各選取2窩仔豬，在免疫接種PRRSV弱毒活疫苗后不同時間采集血清，應(yīng)用RT-PCR檢測PRRSV核酸，應(yīng)用N-ELISA和G-ELISA兩種試劑盒檢測PRRSV抗體。結(jié)果，免疫前0d可以從仔豬血清中檢測到PRRSV野毒株核酸，直到免疫后30 d;相對應(yīng)的母豬在免疫前0d可從血清檢測到PRRSV野毒株核酸。試驗仔豬在免疫前0d未能檢測到PRRSV抗體，但在免疫后30d直到150 d試驗結(jié)束均可

8、檢測到PRRSV抗體，其中N-ELISA試劑盒的陽性檢出率在免疫后30、60 d高于G-ELISA試劑盒的陽性檢出率，而在免疫后120、150 d則低于G-ELISA試劑盒的陽性檢出率。使用兩種ELISA試劑盒共同時檢測216份血清樣品，檢測結(jié)果的符合率為95.83％;配對x2檢驗，P＞0.05，兩者差異不顯著;kappa值為0.87，屬于極強一致性;兩者相關(guān)系數(shù)r為0.605，具有顯著線性相關(guān)。表明，免疫接種弱毒活疫苗可以有效清除野毒

9、感染豬群中的野毒株，N-ELISA和G-ELISA兩種ELISA試劑盒均可用于評估弱毒活疫苗的免疫效果。
　　4.高水平母源抗體仔豬免疫接種PRRSV弱毒活疫苗的效果分析
　　本研究于大型規(guī)模養(yǎng)殖場進(jìn)行兩次試驗，每次選取3窩仔豬，在免疫接種PRRSV弱毒活疫苗后不同時間采集血清，應(yīng)用RT-PCR檢測PRRSV核酸，應(yīng)用N-ELISA和G-ELISA兩種試劑盒檢測PRRSV抗體。結(jié)果，在免疫接種后60 d內(nèi)可在試驗豬血清中檢測

10、到疫苗株核酸，而在整個試驗期間始終未能檢測到野毒株核酸。試驗豬在免疫后0d具有較高的母源抗體，陽性率達(dá)到100％，此后逐漸下降，第28/60 d（第2次試驗/第1次試驗）達(dá)到低點后穩(wěn)步提高，從第60/90d到150 d試驗結(jié)束陽性率均為100％。應(yīng)用兩種ELISA試劑盒同時檢測采集的329份血清樣品，檢測結(jié)果的符合率為96.96％;配對x2檢驗，P＞0.05，兩者差異不顯著;kappa值為0.81，屬于極強一致性;兩者相關(guān)系數(shù)r為0.7