Viperin蛋白抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制及其分子機(jī)制.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)屬于套式病毒目，動(dòng)脈炎病毒科，動(dòng)脈炎病毒屬的有囊膜單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)15kb左右，具有nsp1-nsp1214個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白和9個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，能造成母豬懷孕后期流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、弱胎、木乃伊胎等，引起仔豬、育肥豬呼吸道癥狀，死亡率升高。該病毒強(qiáng)烈抑制干擾素的產(chǎn)生，但外源IFNs對(duì)該病毒的復(fù)制具有強(qiáng)烈的抑制作用。Viperin屬于干擾素刺激基因，對(duì)多種病毒均具有抗病毒作用。本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增并克隆了豬和猴的

2、Viperin基因，制備了該蛋白的多克隆抗體，首次證明了猴的Viperin蛋白具有抑制PRSV復(fù)制的作用，并揭示了其抗病毒機(jī)理。構(gòu)建了豬的Viperin蛋白腺病毒表達(dá)載體，并在Marc-145細(xì)胞和PAMSs細(xì)胞上驗(yàn)證了豬Viperin蛋白對(duì)PRRSV的抗病毒作用，具體實(shí)驗(yàn)如下:
　　1.豬、猴Viperin基因的克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)與抗體制備
　　Viperin基因作為干擾素下游基因(ISG)，本實(shí)驗(yàn)為研究其抗病毒活性

3、，從Marc-145和PK-15細(xì)胞提取并克隆了該基因。將Marc-145細(xì)胞和PK細(xì)胞鋪24板，用IFN-α刺激24h后收集細(xì)胞，提取RNA，分別采用RT-PCR方法擴(kuò)增猴和豬的Viperin基因，并克隆進(jìn)入pEASY-blunt simple平末端連接測(cè)序載體，酶切鑒定后送公司測(cè)序。采用DNAstar分析豬和猴Viperin蛋白的免疫原性和疏水性，選取抗原性較好的一段基因，采用PCR擴(kuò)增后，插入pET-28a+大腸桿菌表達(dá)載體，在3

4、7℃條件下IPTG誘導(dǎo)含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21，SDS-PAGE分析證明Viperin重組蛋白以包涵體的形式表達(dá)，包涵體蛋白經(jīng)過(guò)純化后得到目的蛋白，將純化蛋白與弗式完全佐劑進(jìn)行乳化后頸背部皮下注射BALB/c小鼠，兩周后加強(qiáng)免疫一次，收集小鼠血清。采用Western-blot、IFA實(shí)驗(yàn)確定制備多克隆抗體的特異性，該多克隆抗體可以分別與腺病毒表達(dá)和真核表達(dá)載體pCI-sVIP等表達(dá)的Viperin蛋白進(jìn)行特異性反應(yīng)，為下一步研究豬

5、和猴Viperin蛋白抗病毒性質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。
　　2.猴Viperin抑制PRRSV復(fù)制及其分子機(jī)制
　　宿主抵抗病毒感染的第一道防線是先天性免疫反應(yīng)。先天性免疫反應(yīng)以干擾素的產(chǎn)生為特征，干擾素可刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列抗病毒蛋白。Viperin是干擾素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白，對(duì)多種病毒的復(fù)制有抑制作用，但抗病毒機(jī)制仍然不明確。本文研究了mViperin蛋白在Marc-145細(xì)胞內(nèi)對(duì)PRRSV復(fù)制的作用，結(jié)果表明，IFN-α接種Ma

6、rc-145細(xì)胞后可誘導(dǎo)mViperin基因的上調(diào)，并可以以劑量依賴和時(shí)間依賴的方式抑制PRRSV復(fù)制。PRRSV感染細(xì)胞后，IFN-α基因的上調(diào)受到明顯抑制，PRRSV通過(guò)干擾素非依賴途徑誘導(dǎo)mViperin基因的表達(dá)。用過(guò)表達(dá)mViperin蛋白可通過(guò)劑量依賴的方式抑制PRRSV在Marc-145細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，采用干擾siRNA方法缺失細(xì)胞內(nèi)Viperin蛋白基因，PRRSV復(fù)制水平有所增加。此外，本研究發(fā)現(xiàn)mViperin蛋白抑制

7、了PRRSV的入胞，阻礙了PRRSV基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，但其對(duì)病毒的裝配和出殼沒(méi)有作用。利用激光共聚焦實(shí)驗(yàn)證明mViperin蛋白和PRRSV的GP5、N蛋白在細(xì)胞內(nèi)存在共定位現(xiàn)象。進(jìn)一步用CO-IP買驗(yàn)驗(yàn)證，mViperin蛋白和PRRSV N蛋白在細(xì)胞內(nèi)可相互作用，并發(fā)現(xiàn)mViperin蛋白N端第12-16位氨基酸對(duì)mViperin的抗病毒活性有重要的影響，mViperinα-helix區(qū)域影響該蛋自在細(xì)胞內(nèi)的定位和形態(tài)分布。<

8、br>　　3.豬Viperin重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定
　　Viperin作為干擾素刺激基因，在多種體細(xì)胞均有表達(dá)，且對(duì)多種種屬的病毒具有抗病毒活性。為了深入研究豬的Viperin蛋白在Marc-145和PAMS細(xì)胞上的抗病毒活性，本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增豬Viperin基因，克隆進(jìn)入穿梭載體pTrack-CMV-sViperin，經(jīng)菌液PCR，酶切鑒定后送公司測(cè)序正確。利用Pme-Ⅰ內(nèi)切酶線性化穿梭裁體，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183后與

9、腺病毒骨架載體pAdEasy-1進(jìn)行同源重組，提取重組后的腺病毒基因組DNA經(jīng)內(nèi)切酶Pac-Ⅰ線性化后轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞，裝配成完整的病毒粒子rAd-Viperin。在顯微鏡下觀察重組腺病毒rAd-Viperin感染細(xì)胞，可見(jiàn)GFP的表達(dá)。通過(guò)RT-PCR、Western-blot檢測(cè)sViperin蛋白的表達(dá)，重組腺病毒可正確表達(dá)豬Viperin蛋白，且具有良好的豬Viperin反應(yīng)原性，為下一步研究豬Viperin蛋白對(duì)PRR

10、SV的抗病毒活性奠定基礎(chǔ)。
　　4.豬Viperin蛋白抑制PRRSV復(fù)制作用研究
　　本研究構(gòu)建了pCI-sVIP表達(dá)載體，并利用pCI-sVIP研究了sViperin蛋白在Marc-145細(xì)胞上對(duì)PRRSV復(fù)制的作用，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)sViperin蛋白可以抑制PRRSV在Marc-145細(xì)胞上的復(fù)制，且具有劑量依賴作用。實(shí)驗(yàn)證明sViperin蛋白抑制病毒的入胞，但其對(duì)病毒的裝配和釋放沒(méi)有影響作用。另外，共聚焦實(shí)驗(yàn)證明

11、sViperin蛋白主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器。sViperin蛋白和病毒的GP5、N蛋白在Marc-145細(xì)胞內(nèi)存在共定位現(xiàn)象，進(jìn)一步利用CO-IP實(shí)驗(yàn)證明，sViperin蛋白可以和N蛋白進(jìn)行共沉淀，證明sVierin蛋白可以和N蛋白相互作用。進(jìn)一步采用表達(dá)重組sViperin蛋白的腺病毒rAd-sVIP接種PAMSs細(xì)胞，結(jié)果證明過(guò)表達(dá)sViperin在PAMSs細(xì)胞以劑量依賴的方式抑制PRRSV的復(fù)制，且腺病毒表達(dá)的sViperi