豬繁殖與呼吸綜合征病毒的感染性克隆及其復(fù)制子載體的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種以妊娠母豬嚴(yán)重繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的傳染病。PRRS自1987年首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)于美國以來，現(xiàn)已遍及世界各主要養(yǎng)豬國家與地區(qū)，并已成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一。我國于1996年首次從國內(nèi)豬群中分離到PRRSV，從而證實(shí)了本病在我國的存在與流行。自2006年6月份以來，在我國南方的湖北、湖南、江西、安徽等省份相繼暴發(fā)高致病性豬藍(lán)耳病，至

2、少200多萬頭豬發(fā)病，40多萬頭豬死亡，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了極為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，引起了社會的廣泛關(guān)注。而正鏈RNA病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)在病毒復(fù)制、致病機(jī)制研究，抗病毒藥物篩選和新型疫苗、導(dǎo)向載體制備等方面是一個(gè)極其有用的工具?；诖耍狙芯块_展了PRRSV Clone20株的全基因組克隆與測序、遺傳進(jìn)化分析、感染性克隆及其復(fù)制子載體的研究。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1．豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）Clone20株

3、全基因組克隆、序列測定及遺傳進(jìn)化分析
　　 以豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）Clone20株為材料，參考GeneBank PRRSV VR2332株（AY150564）全基因序列，我們分四段設(shè)計(jì)引物，通過RT-PCR擴(kuò)增了PRRSV Clone20株全基因組，將所得的cDNA克隆到pMD18-T載體中進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果表明：覆蓋全基因組cDNA重疊片段A、B、C和D大小依次為3920bp、5715bp、3783bp和3

4、323bp，測序結(jié)果經(jīng)分析正確后，利用DNASTAR軟件將4個(gè)片段拼接成完整基因組序列，獲得全基因組核苷酸序列為15412bp（不含poly（A）尾）；該序列已經(jīng)遞交給GenBank，序列登錄號為：FJ899592。
　　 遺傳進(jìn)化樹分析表明，我國流行的毒株可以分為2個(gè)亞群：以CH-1a為代表的包括JXA1，HUN4等高致病性變異毒株在內(nèi)的屬于亞群1；以VR2332為代表的包含少量國內(nèi)分離毒株屬于亞群2。而本研究的Clone20

5、株屬于美洲型，在系統(tǒng)發(fā)生樹上Clone20與CC-1、MLV和BJ-4株位于同一小分支，與美洲型參考株（VR-2332株）同屬于亞群2。
　　 同時(shí)利用ClustalX2軟件對25株P(guān)RRSV全序列同源性分析后，進(jìn)一步用Simplot軟件對可能產(chǎn)生重組的序列進(jìn)行相似性分析和BOOTSCAN分析；結(jié)果顯示，我國的PRRSV HB-1株為CH-1a與JX143的重組病毒株，確定了重組區(qū)域?yàn)?2665-14105，證實(shí)了重組在PRRS

6、V進(jìn)化過程起著非常重要的作用。
　　 2．豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）Clone20株感染性克隆的構(gòu)建
　　 本研究使用高保真DNA聚合酶進(jìn)行基因擴(kuò)增，每個(gè)片段的陽性克隆送3個(gè)進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果同GenBank中收錄的序列進(jìn)行比較，盡可能地減少PCR引入的突變，獲得了較為可靠的基因組cDNA序列。將4個(gè)基因片段A、B、C、D依次克隆到低拷貝質(zhì)粒pOK-12中，同時(shí)在全基因組5’端引入CMV啟動子序列，在3’端

7、poly（A）后分別引入核酶HDV序列和BGH終止序列，最終獲得該毒株的全長cDNA克隆pOK-Clone20。將質(zhì)粒pOK-Clone20用質(zhì)脂體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)上清接種Marc-145細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)3代，傳至第三代出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增sgmRNA7，大小和測序同預(yù)期相符，證實(shí)獲得了有感染性的恢復(fù)病毒，表明成功的構(gòu)建出了具有感染性的PRRSV全長cDNA克隆。為以后在cDNA水平上研究PRRSV的

8、病毒復(fù)制、致病機(jī)制研究，抗病毒藥物篩選和新型疫苗、導(dǎo)向載體制備等方面提供技術(shù)平臺。
　　 3．豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）復(fù)制子載體的研究
　　 為構(gòu)建含有報(bào)告基因的豬繁殖與呼吸綜合征病毒亞基因組復(fù)制子系統(tǒng)，我們首先在構(gòu)建感染性克隆策略的基礎(chǔ)上，利用PCR方法對C片段和D片段上的含ORF2-ORF6的基因進(jìn)行缺失，在結(jié)構(gòu)基因中保留與豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制想關(guān)的N蛋白序列、上游含TRS7的序列及下游的3’端非編

9、碼順式激活序列，同時(shí)利用PCR的方法引入報(bào)告基因EGFP，另外，像構(gòu)建感染性克隆一樣，在復(fù)制子5’端引入CMV啟動子序列，在3’端poly（A）后分別引入核酶HDV序列和BGH終止序列，然后按感染性克隆構(gòu)建策略依次把各個(gè)片段克隆到低拷貝質(zhì)粒pOK-12中，最終獲得含報(bào)告基因EGFP的復(fù)制子系統(tǒng)質(zhì)粒pOK-Clone20-rep。將質(zhì)粒pOK-Clone20-rep用質(zhì)脂體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，通過觀察EGFP熒光、流式分析和RT-PCR

10、，穩(wěn)定性試驗(yàn)等方法對復(fù)制子進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，pOK-Clone20-rep在在BHK-21細(xì)胞中均可穩(wěn)定表達(dá)EGFP，可以在BHK-21細(xì)胞中檢測到N sgmRNA和EGFP sgmRNA，流式分析顯示在pOK-Clone20-rep轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞中有9.64％的細(xì)胞發(fā)出熒光，結(jié)果表明，PRRSV復(fù)制子在BHK-21細(xì)胞中能夠正常表達(dá)和自我復(fù)制。本研究所購建的含有報(bào)告基因的PRRSV亞基因組復(fù)制子系統(tǒng)在BHK-21細(xì)胞中均獲得

11、了穩(wěn)定表達(dá)，復(fù)制子的成功構(gòu)建為其進(jìn)一步發(fā)展成疫苗載體、為研究病毒復(fù)制、致病機(jī)制研究及抗病毒藥物篩選奠定了基礎(chǔ)。
　　 為了進(jìn)一步探討PRRSV復(fù)制子作為疫苗載體的可能性，以小鼠為模型動物，將復(fù)制子載體pOK-Clone20-rep以不同劑量（100μg和10μg）免疫小鼠，試驗(yàn)結(jié)果表明，無論體液免疫還是細(xì)胞免疫，復(fù)制子載體都能較高的體液免疫水平和細(xì)胞免疫水平，具有較好的免疫效果。同時(shí)復(fù)制子也能夠激發(fā)對N蛋白的體液免疫，表明PRR