豬IFITM家族基因的克隆及其對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒增殖的影響.pdf

1、干擾素(Interferon，IFN)是一類由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性，現(xiàn)已廣泛用于人醫(yī)臨床多種疾病的治療，但干擾素的抗病毒作用并不是直接殺傷或抑制病毒，而是通過與細(xì)胞表面受體相互作用，誘導(dǎo)干擾素刺激基因(IFN stimulated genes，ISGs)表達(dá)多種抗病毒蛋白，從而抑制病毒的感染與復(fù)制。
　　 IFITM(Interferon induced transmem

2、brane protein)蛋白基因家族是最早被確定的干擾素誘導(dǎo)基因(族)之一，包括IFITM1、IFITM2、IFITM3三個(gè)功能性成員，分別編碼14.6、14.5和13.9kDa的蛋白，這些蛋白在抗病毒、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、抗腫瘤、免疫監(jiān)視方面起著顯著作用。
　　 豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是動(dòng)脈炎病毒屬的成員，引起豬

3、的繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome，PRRS)，該病自1987年發(fā)生以來一直嚴(yán)重危害著世界養(yǎng)豬業(yè)，篩選有效的抗病毒基因有望為PRRSV的防控提供新的思路。為此，本研究主要克隆了豬IFITM基因并對(duì)其與PRRSV的相互作用進(jìn)行了研究(本研究中豬IFITM基因指豬IFITM1，IFITM2，IFITM3三個(gè)基因)，主要內(nèi)容如下：
　　 1.豬IFITM基因的擴(kuò)

4、增、序列分析及進(jìn)化樹的繪制
　　 通過對(duì)已知的其他物種IFITM基因的序列進(jìn)行比對(duì)分析，預(yù)測(cè)了豬IFITM家族基因序列，并根據(jù)預(yù)測(cè)的序列分別設(shè)計(jì)特異性引物，從PK-15細(xì)胞中通過RT-PCR擴(kuò)增獲得豬IFITM基因。經(jīng)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)豬IFITM家族的核苷酸序列全長(zhǎng)分別為375bp、435 bp、438 bp，分別編碼124、144、145個(gè)氨基酸殘基，豬IFITM1與牛、人、鼠、猴的氨基酸序列同源性分別為71%、64%、57%、5

5、6%；豬IFITM2與牛、人、鼠的氨基酸序列同源性分別為76%、68%、54%；豬IFITM3與牛、人、鼠、猴的氨基酸序列同源性分別為73%、69%、62%、56%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明：不同物種IFITM家族的氨基酸序列存在較大差異，其中豬IFITM與牛IFITM的親緣關(guān)系最近。
　　 2.豬IFITM的亞細(xì)胞定位
　　 將豬IFITM基因家族的3個(gè)成員分別克隆至pEGFP-C2中，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C2-IF

6、ITM1、pEGFP-C2-IFITM2、pEGFP-C2-IFITM3，轉(zhuǎn)染PK-15、293細(xì)胞，DAPI染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)豬IFITM家族定位于細(xì)胞膜。
　　 3.豬IFITM家族對(duì)PRRSV增殖的影響
　　 將構(gòu)建的IFITM基因的真核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染SJPL細(xì)胞和CD163-293細(xì)胞，然后接種PRRSV WUH3株，并于接毒后24h收毒，絕對(duì)定量和空斑試驗(yàn)檢測(cè)PRRSV的增殖情況，結(jié)果證實(shí)豬I

7、FITM家族顯著抑制PRRSV的增殖
　　 4.PRRSV感染對(duì)豬IFITM家族的影響
　　 將pEGFP-C2-IFITMs真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，接種PRRSV，DAPI染色，激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)PRRSV感染不改變豬IFITM家族在細(xì)胞中的定位。
　　 用PRRSV感染PAM細(xì)胞，相對(duì)定量分析PRRSV感染對(duì)豬IFITM基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)PRRSV在感染PAM細(xì)胞后9h能誘導(dǎo)豬IFIT