豬繁殖與呼吸綜合征病毒M、N基因克隆及N基因表達應用研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是引起豬繁殖障礙和呼吸道疫病的病原之一，病毒的M、N蛋白上具有保守性抗原位點，抗原性好。本研究進行了PRRSVC14-2分離株M、N全基因的克隆分析，構建了N基因的pET-32a-N原核表達載體，建立了以重組N蛋白為抗原檢測PRRS的間接ELISA方法。 實驗參考PRRSV美洲型毒株VR2332株的基因序列，設計了M、N基因的特異性引物P1/P2及P3/P4，通過RT-PCR擴增出PRRSVC

2、14-2分離株的M、N全基因。以pMD18-T為載體對M、N基因進行了克隆。序列測定表明，M基因長522bp，編碼174個氨基酸；N基因長369bp，編碼128個核苷酸。序列分析表明，M基因與VR2332株和LV株核苷酸同源性分別為99.0％及67.8％，編碼氨基酸同源性分別為98.3％及77.5％；N基因與VR2332株和LV株的核苷酸同源性分別為99.7％及65.1％；編碼氨基酸同源性分別為99.2％及57.7％。進化分析表明，C1

3、4-2株與美洲型毒株遺傳距離較近，從分子水平上證實了C14-2分離株屬于美洲型毒株。 將pMD18T-N中的N基因亞質克隆進pET-32a(+)，構建了N基因的pET-32a-N原核表達載體，并將其轉化進表達宿主菌E.coliBL21(DE3)中進行誘導表達。表達產物經SDS-PAGE電泳分析，獲得了一條約35kDa大小的濃縮蛋白帶。優(yōu)化實驗確定了重組蛋白的最佳誘導表達條件：IPTG終濃度0.8～1.0mM，誘導時間3～4h。定

4、位分析表明融合蛋白以可溶性蛋白與不溶性蛋白兩種蛋白形式(包涵體)存在于細胞質中。在變性及自然條件下分別以組氨酸純化試劑盒對重組表達蛋白進行親合純化。蛋白質免疫印跡試驗結果顯示，重組表達蛋白與抗PRRSV的豬血清發(fā)生特異性反應，表明其具有抗原活性。 以重組表達融合蛋白作為包被抗原，建立了診斷PRRS的間接ELISA方法。實驗確定了最佳抗原包被濃度為3.99μg/ml，血清稀釋度為1：40。陽性標準初步確立為：OD450＞0.293

5、。特異性實驗結果顯示，間接rN-ELISA與豬布氏桿菌病、豬瘟、豬大腸桿菌病、豬口蹄疫、豬細小病毒病、豬偽狂犬病陽性血清不發(fā)生交叉反應。重復性實驗結果顯示，間接rN-ELISA批內與批間檢測樣品結果的平均變異系數分別為3.9493％及6.161％，表明重復性好。間接rN-ELISA與IDEXXHerdCheckELISA比較結果表明，間接rN-ELISA具有高敏感性及強特異性。 本論文研究進行的PRRSVM、N基因克隆與分析，N