豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及結(jié)構(gòu)蛋白基因的克隆與序列分析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的烈性傳染病。在臨床上主要表現(xiàn)為妊娠母豬發(fā)熱、厭食、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙，新生及斷奶前仔豬高死亡率以及各年齡段尤其是仔豬的呼吸道

2、疾病等特征。該病最早于1987年報(bào)道于美國南部，現(xiàn)已遍及世界各地，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。盡管我國1995年才首次暴發(fā)此病，但根據(jù)臨床和血清學(xué)調(diào)查，該病在我國普遍存在，而且近年來還呈流行態(tài)勢。 豬繁殖與呼吸綜合征病毒是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，依據(jù)基因序列分析，將PRRSV劃分為兩種基因型，即以LV株為代表的歐洲型和以VR2332株為代表的北美洲型。同其它有囊膜的RNA病毒一樣，PRRSV基因存在高度的變異性，PRR

3、SV的同型毒株之間基因nt序列存在不同程度差異，而歐美洲型毒株之間差異更大。近年來分離的PRRSV的序列和抗原分析發(fā)現(xiàn)，不同分離株間在毒力、基因序列和抗原性方面都存在著較大的變化。 為此，本研究從臨床發(fā)病豬采集病料，進(jìn)行了病毒的分離鑒定，并成功分離到一株P(guān)RRSV，對(duì)其結(jié)構(gòu)蛋白基因進(jìn)行克隆、測序及遺傳進(jìn)化分析，以期找出該分離株與其它流行株及疫苗株問的親緣關(guān)系及遺傳進(jìn)化規(guī)律，為PRRS的流行病學(xué)調(diào)查及PRRS的致病機(jī)制的研究奠定基

4、礎(chǔ)。具體內(nèi)容如下： 1、PRRSV的分離鑒定 將從黃石一發(fā)病豬場的病豬血清和肺臟經(jīng)處理后接種MARC-145細(xì)胞，結(jié)果血清接種細(xì)胞沒有出現(xiàn)病變，而肺臟接種細(xì)胞在盲傳第二代時(shí)出現(xiàn)了PRRSV所致的特征性病變。而用同樣的血清和病料接種的BHK-21、PK-15和IBRS-2細(xì)胞均沒有病變，盲傳3代后，也同樣沒有出現(xiàn)病變。這與PRRSV能在MARC-145細(xì)胞上增殖，但不能在BHK-21、PK-15和IBRS-2上增殖是一致的

5、。將分離得到的病毒在MARC-145細(xì)胞上傳代得到的上擴(kuò)大培養(yǎng)后測定TCID<,50>為100<'-3.61>/0.1mL。用本室自制的PRRSV、PRV、FMDV、HCV、PPV和JEV陽性血清，對(duì)分離毒株進(jìn)行中和試驗(yàn)，結(jié)果所分離的病毒只能被美洲型PRRSV陽性血清所中和，不能被PRV、FMDV、HCV、PPV和JEV陽性血清所中和。將獲得的病毒經(jīng)非線性蔗糖密度梯度離心，分別收集各梯度區(qū)帶上的蛋白提取物，并進(jìn)行負(fù)染，在電子顯微鏡下觀察

6、。結(jié)果在35％與45％蔗糖之間收集的條帶觀察到大小約為50～60nm的病毒粒子，有囊膜，呈球形。其大小及形態(tài)與PRRSV一致，這進(jìn)一步也證實(shí)了所分離的病毒為豬繁殖與呼吸綜合征病毒，將其命名為PRRSV HS株。 2、HS結(jié)構(gòu)蛋白基因的克隆、測序及序列分析 利用RT-PCR擴(kuò)增出HS株各結(jié)構(gòu)蛋白基因的cDNA片段，將擴(kuò)增的各cDNA片段克隆入pMD18-T載體并測序。應(yīng)用DNAMAN軟件，將測序結(jié)果與國內(nèi)外已發(fā)表野毒株和疫

7、苗株(VR-2332、Resp MLV、16244B、HN1、BJ-4、CH1-a、HB-1、HB-2、LV)的相應(yīng)基因進(jìn)行序列比較，并將推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行同源性比較和遺傳變異分析，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，HS株與美洲型的相應(yīng)基因核苷酸同源性為83.6％-99.7％，與LV株的相應(yīng)基因核苷酸同源性為38.9％-49％；推導(dǎo)的氨基酸與美洲型相應(yīng)基因的同源性為86.6-99.6％，與LV株的同源性為54.2％-78.2％。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，