含Hsp70的豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5及N蛋白基因的核酸疫苗構(gòu)建及免疫研究.pdf

1、本試驗(yàn)根據(jù)Genbank發(fā)表的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)ORF5基因、ORF7基因和結(jié)核分枝桿菌Hsp70基因設(shè)計(jì)合成特異性引物，以本實(shí)驗(yàn)室保存的PRRSV-SCQ株提取其總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增出369bp的目的片段ORF7A(含終止子)和ORF7B.并克隆到pMD19-T載體中；以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pMD18-T-ORF5和pMD18-T-Hsp70為模板，PCR擴(kuò)增出516bp和1878bp的目的片段ORF5和Hsp

2、70，其分別克隆到pMD19-T上；擴(kuò)增PRRSV-SCQ株ORF7A和ORF7B基因分別插入pMD19-T-ORF5中，得到T-ORF5-ORF7A和T-ORF5-ORF7B。將兩者克隆到pCI-neo上，獲得pCI-ORF5-ORF7A和pCI-ORF5-ORF7B；再將Hsp70插入pCI-ORF5-ORF7B，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pCI-ORF5-ORF7B-Hsp70。將pCI-ORF5-ORF7B-Hsp70DNA疫苗免疫健康小白

3、鼠，同時(shí)設(shè)立pCI-ORF5-ORF7ADNA、pCI-neoDNA、PRRS弱毒疫苗、生理鹽水4個(gè)對(duì)照組，斷尾采血并檢測(cè)ORF5、ORF7和Hsp70的mRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)、細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4水平以及T淋巴細(xì)胞亞群變化。結(jié)果顯示如下：
　　 1、通過(guò)質(zhì)粒的重復(fù)測(cè)序表明，本研究成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCI-ORF5-ORF7A和pCI-ORF5-ORF7B-Hsp70。
　　 2、真核重組表達(dá)質(zhì)粒pCI-ORF5

4、-ORF7A和pCI-ORF5-ORF7B-Hsp70分別接種小鼠14d后，在小鼠外周血（經(jīng)DNase處理）中均能檢測(cè)到ORF5和ORF7基因的mRNA:在接種過(guò)pCI-ORF5-ORF7B-Hsp70的小鼠外周血（經(jīng)DNase處理）中可擴(kuò)增出Hsp70基因的mRNA，表明重組DNA在小鼠體內(nèi)得到了有效轉(zhuǎn)錄。
　　 3、重組質(zhì)粒pCI-ORF5-ORF7B-Hsp70免疫小鼠后，14d、21d、28d、35d、42d時(shí)，用ELI

5、SA試劑盒檢測(cè)血清中PRRSV特異性抗體水平，該組抗體水平高于pCI-ORF5-ORF7A組和PRRS弱毒疫苗組，其28d抗體水平(OD630值為0.875)達(dá)到峰值，42d抗體水平(OD630值為0.782)有所回落；極顯著大于pCI-ORF5-ORF7A組，顯著(p＜0.05)大于PRRS弱毒疫苗組。
　　 4、使用ELISA試劑盒在35d時(shí)檢測(cè)IFN-γ和IL-4，pCI-ORF5-ORF7B-Hsp70組的IFN-γ(1

6、96.35pg/mL)和IL-4(53.27pg/mL)分泌水平最高；極顯著(p＜0.01）大于pCI-ORF5-ORF7A組；顯著(p＜0.05)大于PRRS弱毒疫苗組；而pCI-neo組和生理鹽水組分泌IFN-γ和IL-4水平均很低。
　　 5、使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群：pCI-ORF5-ORF7B-Hsp70組的小鼠外周血T細(xì)胞CD3+水平(78.39％)最高，極顯著(p＜0.01)大于pCI-ORF5-

7、ORF7A組和PRRS弱毒疫苗組；CD4+水平(51.72％)同樣最高，極顯著(p＜0.01）大于pCI-ORF5-ORF7A組，顯著(p＜0.05)大于PRRS弱毒疫苗組；CD8+水平(24.66％)與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(p＞0.05)；CD4+/CD8+比值最高，但與對(duì)照組相比差異不顯著(p＞0.05)。
　　 本研究所構(gòu)建的以Hsp70為分子佐劑的PRRSV-ORF5-ORF7核酸疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答，為P