豬繁殖與呼吸綜合征病毒在ORF7和3’UTR之間插入外源基因的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一種豬繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)的高度接觸性傳染病。我國于1996年首次報道此病并分離出病毒，隨后該病在我國廣泛傳播。用于防控PRRSV的傳統(tǒng)疫苗不能區(qū)分野毒，滅活苗保護(hù)率低下

2、，而弱毒苗存在可能毒力返強(qiáng)和毒株間交叉保護(hù)性差等問題。因此開發(fā)PRRSV標(biāo)記疫苗和利用PRRSV基因組作為病毒載體的重組活載體疫苗研究成為了當(dāng)今PRRS疫苗的研究熱點方向之一。
　　本研究采用PCR的方法在PRRSV毒株vJX25HB全長cDNA克隆載體pAJX25HB的基礎(chǔ)上，在其ORF7和3'UTR之間插入BstBⅠ、SbfⅠ酶切位點和轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列TRS，構(gòu)建獲得了pAJX25HB-73BS-TRS表達(dá)載體。之后將外源基因EG

3、FP(green fluorescent protein)、PRRSV-ORF4、EAV(equine arteritis virus,EAV)-ORF4、EAV-ORF5a插入該載體BstBⅠ酶切位點和SbfⅠ酶切位點之間，獲得了以下重組質(zhì)粒:pAJX25HB-73BS-TRS-EGFP、pAJX25HB-73BS-TRS-PRRSV-ORF4、pAJX25HB-73BS-TRS-EAV-ORF4、pAJX25HB-73BS-TRS-

4、EAV-ORF5a。將所有的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞獲得包裝好的病毒粒子，再轉(zhuǎn)接到MARC-145細(xì)胞上進(jìn)行病毒拯救。結(jié)果表明，重組的病毒能夠在MARC-145細(xì)胞中產(chǎn)生典型的CPE(cytopathic effect)。RT-PCR和IFA分析也能檢測到病毒的基因組和PRRSV特異的N蛋白的表達(dá)。重組病毒傳至第3代，RT-PCR擴(kuò)增、酶切和測序結(jié)果顯示重組的PRRS病毒都含有特征性分子標(biāo)記（人工PCR突變插入的限制性內(nèi)切酶Sb

5、fⅠ酶切位點）和插入的外源基因序列;多步生長曲線實驗結(jié)果表明，所有拯救的重組病毒在MARC-145細(xì)胞上的增殖特性與親本病毒相似，病毒的滴度在第36h時達(dá)到最高值，并且前48h的病毒增殖速度明顯高于親本病毒vJX25HB，rJX25HB-73BS-TRS-PRRSV-ORF4在60h之后其病毒滴度始終最低，rJX25HB-73BS-TRS-EGFP的初始病毒滴度最低，可能是與其插入的外源堿基數(shù)量最大有關(guān)。另外，作為同為插入EAV的外源基