豬繁殖與呼吸綜合征病毒SCQ株ORF5基因的克隆、生物信息學(xué)分析及dORF5基因原核表達(dá)的初步研究.pdf

1、GP5是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)的重要結(jié)構(gòu)蛋白和免疫保護(hù)蛋白之一，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，目前被認(rèn)為是研制PRRS新型分子診斷試劑和新型疫苗的良好侯選材料。 本研究從單層細(xì)胞MARCO-145感染PRRSVSCQ后提取總RNA，應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增得到PRRSV-SCQ株ORF5基因并將其克隆至PMD18-T載體。應(yīng)用

2、生物學(xué)軟件及互聯(lián)網(wǎng)在線服務(wù)器對(duì)PRRSV-SCQ株GP5蛋白進(jìn)行了疏水性、跨膜區(qū)、信號(hào)肽、潛在抗原位點(diǎn)和二級(jí)結(jié)構(gòu)等的預(yù)測(cè)，并初步討論了其結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。GP5蛋白一共含有3個(gè)跨膜區(qū)，6個(gè)潛在抗原表位和一段位于N端1-31位氨基酸信號(hào)肽，C端則含有多個(gè)無規(guī)則螺旋卷曲。在了解這些預(yù)測(cè)結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，應(yīng)用PCR方法從重組質(zhì)粒PMD-18-T-ORF5中擴(kuò)增得到缺失了N端信號(hào)肽序列(同時(shí)也是疏水跨膜區(qū))但保留了主要抗原表位編碼

3、區(qū)的基因片段dORF5，將dORF5克隆至原核表達(dá)載體PBAD/Myc-HisB上，經(jīng)菌落PCR方法、酶切以及測(cè)序鑒定，證明成功地構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒PBAD/Myc-HisB-dORF5。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE可檢測(cè)到分子質(zhì)量約為19.4kDa的目的蛋白。目的蛋白經(jīng)蛋白質(zhì)分析軟件Bandscan分析，結(jié)果表明表達(dá)的量占菌體總蛋白的17.1％；Western-blotting