大乳頭水螅Wnt-3基因的克隆、生物信息學(xué)分析及原核表達(dá).pdf

1、Wnt蛋白家族是一類通過自分泌、旁分泌途徑激活不同的Wnt信號通路的信號糖蛋白,Wnt介導(dǎo)的信號通路在動物的生長發(fā)育過程中廣泛的存在并起重要的調(diào)節(jié)作用。近期完成的水螅核基因組測序項目結(jié)果顯示,水螅也具有一系列脊椎動物Wnt基因的同源基因。許多證據(jù)表明高等動物Wnt蛋白家族中的Wnt-3蛋白直接參與動物胚胎發(fā)育早期體軸的決定和形成過程的調(diào)節(jié),因此我們選擇以水螅Wnt-3基因為突破口,研究Wnt蛋白在水螅極性體制的決定及形成過程中作用角色。

2、基于此,本研究圍繞大乳頭水螅Wnt-3基因進(jìn)行了以下實驗工作:
　　1.提取大乳頭水?？俁NA,采用SMART技術(shù)制備大乳頭水螅RACE cDNA文庫,再以該文庫為模板擴增了大乳頭水螅Wnt-3基因cDNA序列,PCR產(chǎn)物純化后與克隆載體pMD-18T連接,轉(zhuǎn)化E.coli JM109菌株。運用菌落PCR方法鑒定陽性克隆后進(jìn)行DNA測序,測序結(jié)果表明大乳頭水螅Wnt-3基因cDNA序列編碼區(qū)全長序列為1089個核苷酸,編碼363個

3、氨基酸。大乳頭水螅Wnt-3基因cDNA序列的成功克隆為深入探討Wnt-3基因的分子進(jìn)化及水螅Wnt-3蛋白的生理功能奠定了基礎(chǔ)。
　　2.基于原核表達(dá)質(zhì)粒pET-LT多酶切位點的特點設(shè)計引物,以已克隆獲得的pMD18-T-Wnt-3重組質(zhì)粒為模板,PCR擴增大乳頭水螅Wnt-3基因片段(編碼區(qū)cDNA序列的第4位點至867位點),再把該基因片段的PCR產(chǎn)物純化后連接到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-LT上,構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-LT-Wn