大乳頭水螅forkhead基因的克隆、生物信息學(xué)分析及原核表達(dá).pdf

1、Forkhead蛋白為一種能通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控來影響動(dòng)物的胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡以及免疫等過程的轉(zhuǎn)錄因子。近期完成的水螅核基因組測(cè)序項(xiàng)目結(jié)果顯示,水螅也具有脊椎動(dòng)物forkhead基因的同源基因。在高等動(dòng)物中,forkhead蛋白是一種直接參與調(diào)控動(dòng)物胚胎發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子,而水螅forkhead蛋白生理功能目前未知、值得深入研究?；诖?本研究圍繞大乳頭水螅forkhead基因進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)工作:
　　1.提取大乳頭水?？?/p>

2、RNA,采用SMART技術(shù)制備大乳頭水螅RACE cDNA文庫(kù),再以該文庫(kù)為模板擴(kuò)增了大乳頭水螅forkhead基因cDNA序列,PCR產(chǎn)物純化后與克隆載體pMD-18T連接,轉(zhuǎn)化E.coli JM109菌株。運(yùn)用菌落PCR方法鑒定陽(yáng)性克隆后進(jìn)行DNA測(cè)序,測(cè)序結(jié)果表明大乳頭水螅forkhead基因cDNA序列編碼區(qū)全長(zhǎng)序列為963個(gè)核苷酸,編碼321個(gè)氨基酸。大乳頭水螅forkhead基因cDNA序列的成功克隆為深入探討forkhea

3、d基因的分子進(jìn)化及水螅forkhead蛋白的生理功能奠定了基礎(chǔ)。
　　2.基于原核表達(dá)質(zhì)粒pET-LT多酶切位點(diǎn)的特點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,以已克隆獲得的pMD18-T-forkhead重組質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增大乳頭水螅forkhead基因片段(編碼區(qū)cDNA序列的第7位點(diǎn)至963位點(diǎn)),再把該基因片段的PCR產(chǎn)物純化后連接到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-LT上,構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-LT-forkhead,轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)菌株