甜菜硝酸還原酶基因克隆及生物信息學(xué)分析.pdf

1、本研究以二倍體栽培甜菜甜研7號為試驗材料，運用RT-PCR并5'/3’-RACE法首次分離了甜菜的NR基因。在此基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)手段對甜菜NRcDNA推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)序列進行主要結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測，旨在從酶分子的結(jié)構(gòu)上揭示甜菜硝酸還原酶的調(diào)控機理。研究結(jié)果如下： 1利用RT-PCR和5'/3’-RACE成功地從甜菜葉片中首次分離了NR的全長基因(SbNR)，登錄號EU163265，長度為3247bp，可編碼905個氨基酸，而

2、且核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列與其它植物NR基因具有較高的同源性。同時運用PCR擴增技術(shù)首次克隆了甜菜NR基因組序列，登錄號為EU571714，測序結(jié)果表明，基因組DNA長度為6346bp，含有4個外顯子和3個內(nèi)含子，內(nèi)含子長度分別為197bp，1088bp和2343bp。 2采用ANTHEPROT軟件分析了SbNR的理化特性，并運用ClustalW服務(wù)器構(gòu)建了SbNR的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，甜菜SbNR為易溶、親水性強的蛋白

3、，理論等電點pI為6.09，相對分子量為102kDa。甜菜NR與菠菜(Spinaciaoleracea)NR的親緣關(guān)系最近。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，NR的α螺旋在30％左右，β折疊在20％左右，表明NR為混合型蛋白。另外，應(yīng)用同源建模法進行NR三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測，NR共有3個β折疊區(qū)，折疊區(qū)間由α螺旋來連接，共有16個螺旋。 3通過網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器平臺進行SbNR的功能預(yù)測，結(jié)果顯示SbNR為NR的成員之一，含有鋁輔因子結(jié)合域，細胞色素b5

4、結(jié)合域，F(xiàn)AD結(jié)合域及NADH結(jié)合域，具有跨膜區(qū)域，但不含有信號肽，表明SbNR可能作為膜受體起作用。 4使用甜菜NR的DNA特異序列作為探針檢測甜菜基因組中NR基因的拷貝數(shù)。采用四種限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ，HindⅢ，BamHⅠ，DraⅠ)消化甜菜的基因組DNA，將凝膠電泳分離的酶切譜帶原位轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，免疫檢測呈現(xiàn)出1-4條不等的雜交信號，其中，EcoRⅠ酶切泳道的雜交條帶最多，并處于3-5kb之間，HindⅢ和DraⅠ