大豆(Glycine max)苯丙氨酸解氨酶基因的克隆和生物信息學(xué)分析.pdf

1、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL，EC4.3.1.5），主要催化L一苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸，為多種酚類及類黃酮終產(chǎn)物提供前體物質(zhì)，是連接初級代謝和苯丙烷類次級代謝第一步反應(yīng)的酶，也是關(guān)鍵酶和限速酶。通過這一途徑可以產(chǎn)生多種具有重要生理功能的次生代謝物質(zhì)，如花色素、木質(zhì)素、植保素等，這些物質(zhì)在植物的生長發(fā)育、抗病、抗逆反應(yīng)中起著重要的作用。
　　 本研究對大豆PAL基因（GmPAL

2、）進(jìn)行克隆，并在此基礎(chǔ)上利用生物信息學(xué)手段對大豆PAL基因家族的兩個成員GmPAL1和GmPAL2推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行主要結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測，主要研究結(jié)果如下：
　　 1運用PCR擴(kuò)增技術(shù)首次克隆了大豆苯丙氨酸解氨酶基因GmPAL2（GenBank accessionnumber：GQ358921）。測序結(jié)果表明，GmPAL2基因組DNA長度為4210bp，含有2個外顯子和1個內(nèi)含子。與此同時克隆了已知的GmPAL1基因組DN

3、A，測序表明其長度為3658bp，和大多數(shù)PAL基因一樣包含兩個外顯子和一個內(nèi)含子。
　　 2利用RT-PCR方法成功地從大豆中克隆了已知的苯丙氨酸解氨酶基因GmPAL1mRNA（GenBank accession number：X52953）和未知的GmPAL2 mRNA（GenBank accession number：GQ220305）。獲得的GmPAL1cDNA基因長度為2144bp，該基因可編碼712個氨基酸，其推導(dǎo)出

4、的氨基酸序列與其它植物PAL基因的具有較高的同源性。獲得的GmPAL2CDNA基因長度為2284b，該基因可編碼717個氨基酸，而且其推導(dǎo)出的氨基酸序列與其它植物PAL基因的也具有較高的同源性。
　　 3用ExPasy軟件包和TOPPRED在線分析GmPAL的理化特性，結(jié)果表明GmPAL1的理論等電點PI=6.14，蛋白質(zhì)相對分子量Mw=77.715kDa：GmPAL2的理論等電點PI=5.83，蛋白質(zhì)相對分子量Mw=78.11

5、6kDa。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，GmPAL1的α螺旋在49.09％左右，延伸鏈在7.11％左右，無規(guī)則卷曲在43.79左右；GmPAL2的α螺旋在48.46％左右，延伸鏈在6.46％左右，無規(guī)則卷曲在45.08左右，表明PAL為混合型蛋白。
　　 運用MEGA2.0軟件構(gòu)建了GmPAL的系統(tǒng)進(jìn)化樹，GmPAL和豌豆（Pisum sativum）、菜豆（Phaseolus vulgaris）的同源性很近。
　　 4運用在線

6、Motiff分析系統(tǒng)，得知推測的PAL1氨基酸序列的194-210區(qū)域和PAL2氨基酸序列的199-215區(qū)域的GTITASGDLvPLSyiaG為PAL的活性位點，屬于植物PAL的特征序列，進(jìn)一步驗證了所得序列均為PAL序列。
　　 啟動子（promoter）是RNA聚合酶能夠識別并與之結(jié)合，從而起始基因轉(zhuǎn)錄的序列，作為轉(zhuǎn)錄水平上一種重要的調(diào)控元件，研究啟動子，對我們了解生物的生長發(fā)育過程，探討生物對其生長環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制以及更

7、好地控制外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)等具有重要意義。
　　 本研究取得的主要結(jié)果如下：
　　 應(yīng)用RAIL-PCR技術(shù)，克隆獲得了大豆PAL1和PAL2的上游啟動子區(qū)，分別為2509bp和1384bp。對獲得的啟動子序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了多個CART-box和TATA-box。TATA框具有將RNA聚合酶Ⅱ引導(dǎo)到正確的轉(zhuǎn)錄起始位點的功能，CART框主要控制著轉(zhuǎn)錄的起始頻率，是調(diào)控轉(zhuǎn)錄速率的元件，與啟動子的特異性無直接的關(guān)系