油橄欖黃酮合成途徑中三個(gè)關(guān)鍵酶基因的克隆及苯丙氨酸解氨酶基因的表達(dá)研究.pdf

1、油橄欖(Olea europaea L.)屬于木犀科(Oleaceae)，是世界上一種重要的優(yōu)質(zhì)木本油料樹種。油橄欖果實(shí)經(jīng)壓榨所得的橄欖油是目前世界上公認(rèn)的最為健康的食用油，具有極佳的天然保健功效與美容功效，被譽(yù)為“液體黃金”、“植物油皇后”。油橄欖中富含的黃酮是一類多酚化合物，在植物生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的生理功能，此外還可以作為藥物具有多種藥理作用，因此具有十分重要的開發(fā)潛力和研究?jī)r(jià)值。
　　黃酮類化合物是植物苯丙烷代謝途徑中的

2、次生代謝物，苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)、查爾酮合酶(chalcone synthase，CHS)和查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase，CHI)是黃酮合成代謝途徑中的三個(gè)關(guān)鍵酶，對(duì)植物中黃酮類物質(zhì)的積累有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)綜合運(yùn)用同源克隆、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)

3、、融合引物嵌套PCR(fusionprimer and nested integrated PCR，F(xiàn)PNI-PCR)與3'-cDNA末端快速擴(kuò)增(rapidamplification of cDNA end，RACE)等分子生物學(xué)技術(shù)，分別從油橄欖中克隆到PAL、CHS、CHI的全長(zhǎng)DNA與cDNA，并進(jìn)行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析，三個(gè)基因分別命名為OePAL、 OeCHS、OeCHI。此外，還對(duì)克隆到的OePAL在畢赤酵母X33中進(jìn)行

4、了誘導(dǎo)表達(dá)，且進(jìn)行了相關(guān)的酶學(xué)性質(zhì)研究。得到如下主要研究結(jié)果。
　　1.OePAL的DNA全長(zhǎng)2970 bp，含有一個(gè)內(nèi)含子(393～1220 bp)，全長(zhǎng)cDNA有2142 bp，開放閱讀框編碼713個(gè)氨基酸，且與其他植物有較高的同源性。氨基酸序列分析顯示，OePAL屬于穩(wěn)定性蛋白，分子式為C3424H5490N944O1052S25，等電點(diǎn)為5.83，不含信號(hào)肽序列;所編碼的多肽鏈中有4個(gè)脫氨位點(diǎn)(L203、V204、L253

5、、AT4)和11個(gè)催化活性位點(diǎn)(N257、G258、N379、D380、N381、H393、H483、N484、Q485、D486、V487)，且包含56.52％的α-螺旋、5.61％的β-轉(zhuǎn)角和30.86％的無規(guī)則卷曲。利用該基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒pPICZα A-OePAL成功地在畢赤酵母X33中進(jìn)行了表達(dá)。SDS-PAGE檢測(cè)顯示該重組酶的分子量在77.5 kD左右，純化后的比活力為196.3U/mg。酶學(xué)性質(zhì)研究表明:該重組酶的最適

6、反應(yīng)條件為40℃，pH8.8;在50℃以下，pH7.7～9.2保溫半小時(shí)酶活力可以保持相對(duì)穩(wěn)定;在供試范圍內(nèi)Cu2+與Na+可以提高該酶活性;以L-苯丙氨酸為底物，在最適條件下該酶的Km為4.89×10-4mol/L。
　　2.OeCHS有3個(gè)外顯子，且包含1個(gè)1173 bp的開放閱讀框，編碼390個(gè)氨基酸，其氨基酸序列與葡萄和番茄全長(zhǎng)CHS氨基酸序列的相似性在90％左右。氨基酸序列分析顯示， OeCHS的相對(duì)分子量為43.044

7、5 kD，分子式為C1915H3053N519O568S19，等電點(diǎn)為6.24，不含信號(hào)肽，屬于不穩(wěn)定性蛋白，活性中心由4個(gè)高度保守的氨基酸殘基(C164、H303、N336、F215)構(gòu)成，空間結(jié)構(gòu)中有44.36％的α-螺旋、6.92％的β-轉(zhuǎn)角和33.08％的無規(guī)則卷曲。
　　3.OeCHI的全長(zhǎng)DNA包含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，全長(zhǎng)cDNA包含有一個(gè)編碼249個(gè)氨基酸多肽鏈的完整ORF，該ORF序列與梨和櫻桃的相似度最高，

8、但也僅為68.84％和67.81％，其編碼的氨基酸序列與金銀花CHI的相似度最高為65.87％。OeCHI中有4個(gè)重要的催化位點(diǎn)(T50、Y108、N115、S192)和7個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)(R38、G39、L40、F49、I52、K111、V112)，屬于細(xì)胞質(zhì)中的一種不穩(wěn)定性蛋白，其分子式為C1202H1890N306O368S4，相對(duì)分子量為26.64 kD，等電點(diǎn)為6.01，在二級(jí)結(jié)構(gòu)中有42.57％的α-螺旋、8.03％的β-轉(zhuǎn)角