苯丙氨酸羥化酶基因新突變的體外表達研究.pdf

1、目的：苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hyroxylase,PAH)基因6 種突變R270G、P275A、F121L、A156P、E183G 和I324N 均為錯意突變,是由本科檢出并報道的新突變,R408Q 為已報道突變。本實驗應用體外表達的方法對這7 種突變進行功能分析,通過檢測其mRNA 水平、蛋白水平及酶活性水平的變化和BH4 反應性分析，探討其突變效應和致病性質(zhì)，進一步明確基因型和表型之間的關系。
　　 方

2、法：（1）應用體外定點誘變技術構(gòu)建含有7種突變型PAH cDNA的表達載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，提取質(zhì)粒并測序驗證。（2）將含有野生型和突變型PAH cDNA的真核表達載體pcDNA3.0瞬時轉(zhuǎn)染COS-7細胞，轉(zhuǎn)染48 h后提取總RNA和總蛋白，應用實時熒光定量PCR法檢測mRNA、免疫印記法檢測蛋白表達量并進行酶活性分析。以野生型PAH作為參照，計算突變型PAH的mRNA水平和蛋白的相對表達量、殘余酶活性。（3）轉(zhuǎn)染后5 h分別更換

3、不含BH4的DMEM培養(yǎng)基和含20 mg/L BH4的DMEM培養(yǎng)基,檢測mRNA和蛋白表達量并進行酶活性分析，觀察野生型和突變型PAH的BH4反應性。
　　 結(jié)果：（1）突變型PAH R270G、P275A、F121L、A156P、E183G、I324N和R408Q 的mRNA 相對表達量分別為野生型的133％，75％，337％，386％,125％,115％和181％；（2）相對于野生型PAH，加入BH4 前后突變型PAH 蛋

4、白相對表達量分別為：R270G ：10.5％→16％, P275A ：56.6％→122.3％, F121L ：54.3％→150.5％, A156P ：8.7％→20.7％,E183G ：8.5％→14％, I324N：67.3％→142.5％，R408Q:85.4％→155.8％；（3）加入BH4 前后突變型PAH 的殘余酶活性分別為：R270G :7.7％→19.3％,P275A:27.6％→52.6％,F121L:19.0％→6

5、0.9％, A156P:10.4％→14.6％,E183G:9.1％→23.8％,I324N:50.6％→109％, R408Q:40.2％→111.4％。
　　 結(jié)論：（1）相對于野生型PAH，突變體R270G、P275A、E183G和I324N的mRNA水平無明顯變化，F(xiàn)121L、A156P和R408Q的mRNA水平有明顯增加；
　　 （2） Western blot檢測發(fā)現(xiàn)除突變體R408Q的蛋白表達量無明顯改變外