綠色棉纖維葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因(Gh3GT4)與苯丙氨酸解氨酶基因(GhPAL1)的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、彩色棉是指棉花（Gossypium）成熟吐絮時(shí)棉纖維帶有天然顏色的棉花類型。由于其纖維天然具有色彩，在棉紡織過程中不需要化學(xué)漂染等工藝處理，其棉織物和棉紗顏色自然、質(zhì)地非常柔軟并且永不褪色，對(duì)環(huán)境和人體健康無危害，因此又被人們稱為“生態(tài)棉”（ecologicalcotton）。目前國(guó)內(nèi)外彩色棉品質(zhì)普遍存在的問題是：鈴小、產(chǎn)量與衣分偏低，色彩單一且色素遺傳不穩(wěn)定，絨短、比強(qiáng)度差，所以彩色棉不能被大面積推廣。雖然利用傳統(tǒng)的育種方法培育出了一

2、些新的彩色棉品種，使彩色棉產(chǎn)量和纖維長(zhǎng)度在一定程度上得到了提升，但無法解決彩色棉纖維顏色單一、色素不穩(wěn)定等問題。人們希望通過基因工程技術(shù)來改良彩色棉品種，但由于對(duì)彩色棉纖維色素形成分子機(jī)制尚不清楚，利用基因工程技術(shù)對(duì)彩色棉的改良研究進(jìn)展緩慢。目前很多研究認(rèn)為彩色棉纖維色素是類黃酮化合物，所以，克隆彩色棉類黃酮合成途徑的關(guān)鍵基因，明確其調(diào)控機(jī)制，將對(duì)利用基因工程手段解決目前彩色棉存在的問題具有十分重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本研究從類黃酮合

3、成途徑中選擇了葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶和苯丙氨酸解氨酶兩條關(guān)鍵基因，研究結(jié)果如下：
　　1.分別以擬南芥（Arabidopsisthaliana）PAL基因氨基酸序列（AAC18870.1）與葡萄（Vitisvinifera）3GT基因氨基酸序列（BAB41020）為探針，在GenBank中與棉花EST進(jìn)行tBLASTn比對(duì)，將同源性高的EST序列拼接后獲得一條棉花PAL基因全長(zhǎng)cDNA序列與一條棉花3GT基因全長(zhǎng)cDNA序列，根據(jù)電子克隆

4、所得到的完整cDNA序列，保守性分析后設(shè)計(jì)引物，以綠色棉纖維總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增獲得了兩條新的基因cDNA序列。Blastx序列分析發(fā)現(xiàn)克隆的2條序列分別屬于苯丙氨酸解氨酶基因家族與葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因家族，將它們命名為GhPAL1（GenBank登錄號(hào)：JN032297）與Gh3GT4。GhPAL1全長(zhǎng)2347bp，編碼721個(gè)氨基酸，具有2個(gè)功能域，即PAL-HAL和Tyr_2_3_mutase；G

5、h3GT4全長(zhǎng)1663bp，編碼451個(gè)氨基酸,在C-端具有高度保守的PSPGbox。
　　2.通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分別對(duì)兩個(gè)基因在綠色棉及對(duì)應(yīng)的近等基因系白色棉不同發(fā)育天數(shù)纖維細(xì)胞和不同器官的表達(dá)進(jìn)行分析，從表達(dá)特征來看，GhPAL1基因在棉纖維、根、莖、葉和花中都有表達(dá)，但在纖維、特別是發(fā)育早期纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，在花后6d綠色棉纖維細(xì)胞中的表達(dá)量是同期白色棉纖維的6倍以上；Gh3GT4基因主要在棉纖維中表達(dá)，在棉花根、莖、

6、葉和花中幾乎不表達(dá)，在綠色棉纖維細(xì)胞發(fā)育的每個(gè)時(shí)期其表達(dá)量都高于白色棉，花后9d與27d出現(xiàn)兩次表達(dá)高峰期，與綠色棉纖維色素分兩次沉積于纖維中腔和次生壁內(nèi)層相吻合。因此我們推測(cè)GhPAL1與Gh3GT4基因表達(dá)活性與綠色棉纖維著色進(jìn)程之間存在一定的相關(guān)性，可能參與綠色棉纖維的色素合成過程并發(fā)揮著重要作用。
　　3.為初步探究GhPAL1與Gh3GT4基因的功能，構(gòu)建了pANDA35HK-GhPAL1/Gh3GT4RNAi干擾表達(dá)載