家蠅β-葡萄糖苷酶基因的克隆及重組表達(dá)研究.pdf

1、目的：克隆家蠅內(nèi)源性β-葡萄糖苷酶（beta-glucosidase，BG）基因、建立原核表達(dá)和真核表達(dá)體系，檢測表達(dá)產(chǎn)物活性，了解家蠅內(nèi)源性BG酶特點，為深入研究家蠅BG酶的獨特性，進一步解釋家蠅極強環(huán)境適應(yīng)能力和發(fā)現(xiàn)新的種群控制措施提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)，為發(fā)現(xiàn)新的有效纖維素酶體系提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　方法：1.以草地貪夜蛾等結(jié)構(gòu)信息相對完整且研究較為透徹的6種代表性昆蟲的β-葡萄糖苷酶基因序列為參照對象，進行氨基酸同源性分析，設(shè)計

2、簡并引物在家蠅cDNA中擴增出家蠅β-葡萄糖苷酶基因(Musca domestica beta-glucosidasegene,bg-1)保守區(qū)域。2.利用5’和3’RACE cDNA末端快速擴增技術(shù)從家蠅cDNA中克隆bg-1基因的3’端和5’端cDNA序列，拼接得到bg-1基因的全長cDNA序列并對其進行生物信息學(xué)分析。3.根據(jù)所得bg-1基因的cDNA序列設(shè)計引物擴增bg-1基因成熟肽的基因片段，進而分別采用原核表達(dá)載體pET-2

3、8a(+)和pEGX-4T-1構(gòu)建原核表達(dá)體系并在大腸桿菌（E.coli）BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá) bg-1基因的融合蛋白（Musca domestica beta-glucosidase fusion protein，BG-1）。4.利用真核表達(dá)載體pPICZaA構(gòu)建表達(dá)體系在酵母細(xì)胞GS115中表達(dá)bg-1基因，并利用制備的多克隆抗體進行免疫印跡對表達(dá)蛋白進行驗證。5.采用七葉苷平板顯色法和DNS法檢測各表達(dá)體系誘導(dǎo)表達(dá)BG-1

4、蛋白的酶活性，并對其性質(zhì)進行初步的分析。
　　結(jié)果：1.利用簡并 PCR技術(shù)從家蠅體內(nèi)克隆得到了長度為1933bp家蠅 bg-1基因的全長cDNA序列，推導(dǎo)其為562個氨基酸殘基組成的蛋白多肽，將其登錄到GenBank，獲得登錄號：JX460804。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，所得bg-1基因的融合蛋白具有信號肽，其成熟肽的理論分子量為65020.6Da，等電點為8.16，半衰期大于20h，蛋白性質(zhì)穩(wěn)定。脂肪族指數(shù)為76.83，為親水

5、性蛋白。2.分別構(gòu)建了家蠅BG酶的pET-28a-bg-1和pEGX-4T-1-bg-1重組表達(dá)質(zhì)粒，采用濃度為1mol/mL異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG）進行誘導(dǎo)表達(dá)后，在65kDa附近均出現(xiàn)特異性蛋白條帶，并分別利用抗 HIS標(biāo)簽或抗GST標(biāo)簽的單克隆抗體進行Westen blot鑒定，證實重組質(zhì)粒在其宿主菌E.coli BL21(DE3)中成功

6、表達(dá)，命名為MDBG-1蛋白和MDBG-2蛋白。3.構(gòu)建了家蠅 BG酶的分泌型真核重組表達(dá)質(zhì)粒 pPICZαA-bg-1，并在酵母細(xì)胞 GS115中進行表達(dá)，以大鼠抗 MDBG-2免疫血清為一抗，辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗進行Westen blot鑒定，證實家蠅bg-1基因的成熟肽在酵母中成功表達(dá)，命名為MDBG-3蛋白。4.采用七葉苷平板法和DNS法對MDBG-1、MDBG-2和MDBG-3進行BG酶活性鑒定和檢測，結(jié)果顯示

7、3種表達(dá)體系所表達(dá)的融合蛋白均具有酶活性，各表達(dá)體系的BG酶活性有顯著差異（P<0.05），酶活性水平高低依次MDBG-2　　結(jié)論：1.家蠅具有內(nèi)源性BG酶基因，屬于糖苷水解酶第一家族。2.采用pET-28a（+）和pEGX-4T-1的原核表達(dá)體系和畢氏酵母真核表達(dá)體系均能誘導(dǎo)表