新的編碼β-葡萄糖苷酶的基因的克隆、表達及表達產物的酶學特性分析.pdf

1、本研究利用β-葡萄糖苷酶的活性篩選策略,對課題組前期構建的堿性污染土壤樣品的宏基因組文庫AL01進行篩選,得到了一個表達β-葡萄糖苷酶活性的陽性克隆pGXAG805。對其進一步亞克隆和序列分析,獲得兩個可能編碼新型β-葡萄糖苷酶的基因的開放閱讀框,分別命名為:bgl1D(Genbank登錄號為FJ686869)和bgl1E(Genbank登錄號為FJ686868)。
　　 生物信息學分析表明:bgl1D基因由519個堿基對組成,

2、bgl1E基因由456個堿基對組成。在核苷酸水平上,bgl1D、bgl1E與已知數據庫中的β-葡萄糖苷酶基因沒有任何相似性。在氨基酸水平上,Bgl1D與其他糖基水解酶蛋白的相似性很低,與來源于弗蘭克氏細菌的糖基水解酶家族3的蛋白有25％的相似性;Bgl1E和來自嗜熱網球菌的一種屬于糖基水解酶蛋白質家族4的水解酶有41％的相似性,和來自Flavobacterium johnsoniae UW101的一種扁桃體消旋酶蛋白有29％的相似性,和

3、來自嗜熱網球菌的一種6-磷酸式-β-葡萄糖苷酶有39％的相似性。
　　 將PCR擴增得到的目標ORF與載體pETBlue-2連接,轉化E.coliBL21(DE3),得到重組菌株pGXAG801、pGXAG803,在含有檸檬酸鐵銨和七葉苷的LA平板上均能表現(xiàn)出β-葡萄糖苷酶活性。
　　 編碼產物經鎳柱純化后,以pNPGlu為底物,對其進行了酶學性質的初步研究,得到以下結論。Bgl1D的最適pH為10.0;最適溫度為30℃

4、;Km可能為0.54 mmol/L;Vmax可能為2.01μmol/min;最適條件下酶活可能為4.91 U/mg;Al3+、Li+、Cu2+、Co2+、Cr3+離子對酶反應有激活作用,Zn2+、Ba2+、Fe3+離子有抑制作用;高濃度葡萄糖對酶活有抑制作用,抑制常數可能為62.2 mM;半衰期可能6 h。Bgl1E的最適pH為10.0;最適溫度為25℃:Km可能為2.12 mmol/L;Vmax可能為4.17μmol/min;最適條件