草酸青霉β-葡萄糖苷酶的過表達(dá)及纖維素酶新調(diào)控位點的篩選.pdf

1、礦物資源是不可再生能源，最近一二百年的瘋狂開采和消耗使得能源危機(jī)這一問題逐步受到重視，隨之產(chǎn)生的環(huán)境惡化問題也越來越嚴(yán)重。探尋一種綠色可再生能源來減少或替代對化石燃料的依賴，可以很好的解決這一問題。生物質(zhì)材料在自然界普遍存在并且具有可再生性，利用微生物分泌的木質(zhì)纖維素降解酶系將木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為液體燃料和高附加值的化學(xué)品，可以有效的改善環(huán)境和緩解能源危機(jī)。草酸青霉能分泌完整的纖維素酶系，并且具有較高的半纖維素酶活力，這些特點更有利

2、于木質(zhì)纖維素的降解。但是纖維素酶的表達(dá)水平較低，使得其并沒有得到廣泛的應(yīng)用，因此，如何對草酸青霉的纖維素酶表達(dá)體系進(jìn)行系統(tǒng)改造進(jìn)而提高其產(chǎn)酶的表達(dá)效能是當(dāng)前面臨的主要問題。所以，對纖維素酶系改造具有重要應(yīng)用意義。
　　根據(jù)草酸青霉的全基因組序列信息和轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)，我們分析草酸青霉中可能存在11個不同的β-葡萄糖苷酶基因，其中包括6個胞內(nèi)酶。由于這些β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)各不相同，導(dǎo)致產(chǎn)生的纖維寡糖和單糖的種類不同，因此，對其它纖維

3、素酶的表達(dá)調(diào)控產(chǎn)生不同的影響，并且在木質(zhì)纖維素底物的降解體系中發(fā)揮著不同的作用。我們對草酸青霉的β-葡萄糖苷酶分別過表達(dá)，分析他們對草酸青霉分泌纖維素酶系的影響，篩選對纖維素酶分泌最具有促進(jìn)作用的基因，從而為草酸青霉的纖維素酶表達(dá)體系系統(tǒng)改造提供新的靶點。
　　由于以草酸青霉114-2為原始菌株構(gòu)建的高產(chǎn)纖維素酶菌株，其分泌的β-葡萄糖苷酶相比外切、內(nèi)切纖維素酶其酶活比例相對偏低，而在這些突變株中，進(jìn)一步過表達(dá)β-葡萄糖苷酶有可能

4、會對其高產(chǎn)纖維素酶的活性造成不利影響。因此，我們設(shè)想另構(gòu)建一株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株，并根據(jù)特定的降解底物以及所需的多種纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的配比，添加到高產(chǎn)菌株分泌的纖維素酶系中進(jìn)行配比，以彌補(bǔ)其β-葡萄糖苷酶組分的不足，從而優(yōu)化生物質(zhì)的降解酶系結(jié)構(gòu)，提高木質(zhì)纖維素的糖化效率。由于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶基因bgl1具有較高的比活力，因此，我們在草酸青霉高產(chǎn)纖維素酶的菌株中，過表達(dá)黑曲霉bgl1基因，構(gòu)建β-葡萄糖苷酶高活性菌株，

5、從而改善木質(zhì)纖維素酶降解體系。
　　草酸青霉JU-A10-S和JU-A10-T是我們實驗室經(jīng)誘變篩選的木質(zhì)纖維素酶高產(chǎn)突變株，然而它們產(chǎn)纖維素酶的性能相差比較明顯。JU-A10-S和JU-A10-T突變株的全基因組已被測序，并進(jìn)行了生物信息學(xué)的比對分析，發(fā)現(xiàn)JU-A10-S和JU-A10-T基因組序列之間存在多個位點的突變。因此，我們推測，它們之間的產(chǎn)酶性能差異，很可能與這些突變位點有直接的關(guān)系。為解析JU-A10-T相比JU-A

6、10-S高產(chǎn)纖維素酶這一重要性能，以及期望發(fā)現(xiàn)未知的纖維素酶表達(dá)調(diào)控的因素及功能單元，我們基于這兩株突變株的基因組SNP位點分析，在草酸青霉野生菌株中分別將包含這些SNP位點的基因組特定序列進(jìn)行敲除，以分析這些SNP位點與纖維素酶表達(dá)調(diào)控之間的關(guān)系，進(jìn)而豐富纖維素酶高產(chǎn)菌株的改造所需的靶點。
　　本論文的主要研究結(jié)果如下:
　　一、草酸青霉β-葡萄糖苷酶的同源過表達(dá)
　　草酸青霉分泌的纖維素酶系可以有效的降解木質(zhì)纖維素

7、，并且與其它纖維素降解真菌相比具有獨特優(yōu)勢，例如酶系比較完整，半纖維素酶活力較高等。根據(jù)草酸青霉的全基因組序列信息，我們分析草酸青霉中可能存在11個不同的β-葡萄糖苷酶基因。為闡釋這11個β-葡萄糖苷酶基因?qū)Σ菟崆嗝估w維素降解效能的影響，我們擬對這些β-葡萄糖苷酶基因分別在草酸青霉野生菌株114-2中過表達(dá)。對這些過表達(dá)菌株的產(chǎn)酶性能分析發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵第三天，CBGL1和CBGL4和CBG5的濾紙酶活高于野生菌株，其中過表達(dá)bgl4轉(zhuǎn)化子

8、的β-葡萄糖苷酶酶活最高，但是相比出發(fā)菌株，其它突變株的濾紙酶活均有不同程度的降低，其中CBGL2降低的最為明顯。發(fā)酵第四天，CBG5的濾紙酶活與野生菌株基本持平，CBGL1、CBGL4濾紙酶活依然有所提高，而CBGL2的濾紙酶活卻依舊大幅降低。以上研究結(jié)果表明，不同β-葡萄糖苷酶基因的過表達(dá)對纖維素酶的整體表達(dá)具有不同的影響，因此，它們在草酸青霉的纖維素酶系中發(fā)揮著不同的作用。
　　二、黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因bgl1在草酸青霉

9、中的過表達(dá)
　　本實驗室自有的纖維素酶高產(chǎn)菌株RE-10，蛋白分泌強(qiáng)度以及纖維素酶的表達(dá)水平較出發(fā)菌株均有大幅度提高，但β-葡萄糖苷酶的表達(dá)相對較低。雖然在這些高產(chǎn)菌株中可以通過過表達(dá)β-葡萄糖苷酶基因的方式解決這一問題，但較強(qiáng)的β-葡萄糖苷酶表達(dá)活性有可能對其它纖維素酶的表達(dá)造成不利影響。根據(jù)我們之前的實驗結(jié)果，在這些高產(chǎn)菌株的發(fā)酵液中添加β-葡萄糖苷酶可以顯著提高纖維素酶的轉(zhuǎn)化效率。同時，考慮到來源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶具有

10、較高的比活力，因此，我們以草酸青霉cbh1的啟動子作為過表達(dá)盒的啟動子，在草酸青霉高產(chǎn)纖維素酶菌株4-1中過表達(dá)黑曲霉bgl1，得到了一株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株B16。B16突變株在發(fā)酵第五天后β-葡萄糖苷酶活力達(dá)到170IU/ml左右。在高產(chǎn)菌株的發(fā)酵液中以FPA∶BG為1∶3的比例添加β-葡萄糖苷酶酶的粗酶液時（B16號突變株的發(fā)酵液），可以將纖維素的轉(zhuǎn)化率提高50％左右。
　　三、突變株JU-A10-S與JU-A10-T基因

11、組SNP位點的分析及纖維素酶表達(dá)新調(diào)控因素的挖掘
　　JU-A10-S與JU-A10-T是實驗室誘變篩選到的高產(chǎn)纖維素酶突變菌株。對其基因組序列比對分析發(fā)現(xiàn)，JU-A10-S與JU-A10-T的基因組序列不存在大片段DNA的差異，然而它們的產(chǎn)纖維素酶的性能有近兩倍差距。為解析JU-A10-T相比JU-A10-S高產(chǎn)纖維素酶這一重要性能，以及期望發(fā)現(xiàn)未知的纖維素酶表達(dá)調(diào)控的因素及功能單元，我們將這些位點在草酸青霉野生菌株中分別進(jìn)行了

12、敲除。對這些SNP位點缺失突變株酶活測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除位于第6號染色體上的其中一個SNP位點所在的A區(qū)域后，突變株的纖維素酶活提升了2.2倍，然而β-葡萄糖苷酶活力為出發(fā)菌株的20％。在不同的碳源下，A突變株的淀粉酶活力相差很大，當(dāng)以1％微晶纖維素作為唯一碳源時，幾乎檢測不到淀粉酶活力;當(dāng)以淀粉作為唯一碳源時，A突變株的淀粉酶活僅為出發(fā)菌株的50％;然而在含有麩皮和微晶纖維素的誘導(dǎo)產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，A突變株的淀粉酶反而超過了出發(fā)

13、菌株。熒光定量結(jié)果顯示，在1％纖維素誘導(dǎo)條件下，A區(qū)域敲除后，草酸青霉纖維素酶核心轉(zhuǎn)錄因子CreA和AmyR的轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)，XlnR的轉(zhuǎn)錄水平則上調(diào)明顯，并且難以檢測到淀粉酶編碼基因15A和胞外最主要β-葡萄糖苷酶基因bgl1的轉(zhuǎn)錄。以上結(jié)果表明，SNP位點所在的A區(qū)域可能與這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的上游調(diào)控信號有關(guān)。A區(qū)域在114-2的基因組上為多重復(fù)非編碼區(qū)序列，并且這些重復(fù)序列成簇分布在草酸青霉的每條染色體上，因此，這種序列的特殊分布