大熊貓腸道纖維素分解菌的篩選及β-葡萄糖苷酶基因的克隆與表達(dá).pdf

1、大熊貓是我國特有的珍稀野生動(dòng)物，以富含高纖維素的竹類為主食，但其消化纖維素的能力不佳，主要依賴于其腸道內(nèi)微生物對纖維素的分解作用，β-葡萄糖苷酶是微生物降解纖維素過程的重要限速酶，不同來源的β-葡萄糖苷酶及其基因在大小、結(jié)構(gòu)以及理化特征上均有不同，本研究從大熊貓腸道內(nèi)分離篩選得到纖維素分解菌，進(jìn)一步研究其β-葡萄糖苷酶的活力及影響因素，構(gòu)建工程菌對β-葡萄糖苷酶基因進(jìn)行表達(dá)，對研究大熊貓腸道微生態(tài)制劑具有重要意義。
　　從雅安碧峰

2、峽野生動(dòng)物園15只大熊貓糞樣中分離、篩選得到5株具有分解纖維素能力的細(xì)菌，分別對5株菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定，初步推斷5株菌均為芽孢桿菌，將5株菌與相關(guān)菌種的16SrDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)均與Bacillussp.(HM17927.1)處于同一分支上，進(jìn)化距離最短，該結(jié)果與BLAST的結(jié)果一致。再結(jié)合16SrDNA測定序列對比分析，可確定5株菌均為厚壁菌門（Firmicutes）的芽孢桿菌屬(Bacilli)。
　　利用

3、水楊苷法分別測得菌株QY、HH、YH、YY、AA的初始β-葡萄糖苷酶酶活分別為3.65 U/mL、2.43 U/mL、2.51 U/mL、1.36 U/mL、7.32 U/mL。選擇酶活力較高的菌株QY、YH、AA，通過改變菌株的接種量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH、碳源、氮源等條件進(jìn)行產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，最終發(fā)現(xiàn)3株菌的酶活力均大幅度提高，分別達(dá)到21.83 U/mL、19.05 U/mL、20.77 U/mL。
　　選擇酶活

4、最大的菌株QY為β-葡萄糖苷酶基因提供菌，克隆β-葡萄苷酶基因bglH，大小為1321 bp，利用表達(dá)載體pET-22b(+)在大腸桿菌BL21成功進(jìn)行了bglH基因的轉(zhuǎn)化和表達(dá)，通過對BL21/pET-bglH誘導(dǎo)后上清進(jìn)行酶活測定，發(fā)現(xiàn)酶活達(dá)到36.3 U/mL。
　　對表達(dá)粗產(chǎn)物進(jìn)行β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究，結(jié)果顯示，表達(dá)得到的β-葡萄糖苷酶最適溫度為36℃，最適pH5.5，30℃時(shí)熱穩(wěn)定性較好，40℃處理20 min，酶

5、活仍能維持原酶活的60％左右，當(dāng)在超過50攝氏度的環(huán)境處理時(shí)，酶活迅速下降，溫度越高，酶活下降越快。在pH5-6.5范圍內(nèi)，相對酶活力都較高，在堿性環(huán)境中，酶活降低更快，顯示出更差的穩(wěn)定性，當(dāng)pH超過8時(shí)，基本喪失酶活。
　　本研究結(jié)果表明，大熊貓腸道內(nèi)存在能夠分解纖維素的細(xì)菌，通過對細(xì)菌產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，可以提高纖維素分解菌的酶活力，同時(shí)對β-葡萄糖苷酶基因的克隆并構(gòu)建工程菌，成功得到了β-葡萄糖苷酶的高效表達(dá)，為以后大熊貓腸道微