油桐油體蛋白等基因的克隆及生物信息學(xué)分析.pdf

1、油桐原產(chǎn)我國,是我國重要的木本油料樹種之一。桐油是優(yōu)質(zhì)干性油,桐油主要成分是以桐酸為主的不飽和脂肪酸,具有重要的工業(yè)用途。桐油還是制備生物柴油的優(yōu)質(zhì)原料。但桐油存在不飽和脂肪酸含量過高的問題。本研究以對年桐近成熟種子為材料,通過構(gòu)建油桐cDNA文庫、簡并PCR,RACE技術(shù),RT-PCR等方法,分離克隆了oleosin、FAD3、FAD9等油桐油脂貯藏、合成的相關(guān)基因,為通過分子生物學(xué)方法來調(diào)控脂肪酸代謝途徑、改良油桐的脂肪酸成分提供科

2、學(xué)的基礎(chǔ)。
　　 1.油桐油體蛋白o(hù)leosin基因的分離鑒定。在本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的油桐種子cDNA文庫中,通過EST序列blast分析,挑取兩個(gè)克隆,用通用引物T3、T7進(jìn)行擴(kuò)增,并回收測序,結(jié)果表明此兩個(gè)VF_oleⅠ、VF_oleⅡ均為全長cDNA,長度分別為738bp,838bp,分別編碼137、154個(gè)氨基酸。通過與別的物種油體蛋白基因氨基酸序列的比對分析,可知油桐中油體蛋白基因N端、C端保守性均較差,中間區(qū)域保守性較高,

3、且均含有脯氨酸節(jié)結(jié)構(gòu)。通過親緣進(jìn)化關(guān)系分析可知VF_oleⅡ與麻瘋樹oleosin2基因在親緣進(jìn)化關(guān)系上最近,氨基酸序列相似性為82％；而VF_oleⅠ則和麻瘋樹oleosin3以及蓖麻具有較近的親緣關(guān)系,氨基酸序列相似性分別為84％、77％。這兩個(gè)油體蛋白已提交至GenBank,登錄號分別為GU245884、GU245885。
　　 2.油桐SAD基因的克隆及序列分析。通過在GenBank中搜索大戟科植物的SAD基因序列,進(jìn)行

4、多序列比對,設(shè)計(jì)簡并引物,擴(kuò)增油桐SAD基因的編碼區(qū)序列。以對年桐近成熟種子為材料提取RNA,反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA,進(jìn)行簡并PCR擴(kuò)增。SAD的編碼區(qū)分別長1179bp,編碼392個(gè)氨基酸。將序列提交至GenBank中,登錄號為Gu363502。對SAD的DNA序列和氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。對年桐SAD與千年桐和麻瘋樹此基因相似性分別達(dá)96％、91％。SAD蛋白分子量為45217.7Da,等電點(diǎn)5.99,不穩(wěn)定系數(shù)41.88,屬

5、于不穩(wěn)定性蛋白,整體上表現(xiàn)出親水性,無跨膜結(jié)構(gòu)。可能不存在信號肽的切割位點(diǎn),是一個(gè)非分泌性蛋白；此蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中以α螺旋、無規(guī)卷曲為主,模體搜索結(jié)果存在N-糖基化位點(diǎn)、依賴于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)等多種功能結(jié)構(gòu)域,SAD蛋白還存在一個(gè)FA_desaturase_2結(jié)構(gòu)域。
　　 3.FAD3、FAD9脫飽和酶基因cDNA克隆及序列分析。在GenBank中搜索油脂F(xiàn)AD3、FAD9脂肪酸脫飽

6、和酶基因序列,通過多序列比對尋找該類基因的保守區(qū),在保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并引物。通過RT-PCR擴(kuò)增,分別得到了486bp、360bp片段。DNA測序及序列分析表明,這兩個(gè)基因片段分別為油桐FAD3和FAD9脫飽和酶基因的部分cDNA。根據(jù)簡并RT-PCR獲得的油桐FAD3和FAD9脫飽和酶基因的部分cDNA序列信息,設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增這兩個(gè)基因完整cDNA末端的3’RACE和5’RACE特異引物。以對年桐近成熟種子為材料提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄制備RA

7、CE readycDNA,進(jìn)行RACE擴(kuò)增。FAD3的3’RACE和5’RACE擴(kuò)增片段長度分別為1200bp、550bp；FAD9的3’RACE和5’RACE擴(kuò)增片段長度分別為470bp、900bp。分別將FAD3、FAD9的簡并片段、RACE片段進(jìn)行人工拼接,預(yù)測起始密碼子和終止密碼子位置,在起始密碼子和終止密碼子附近設(shè)計(jì)引物；通過RT-PCR,擴(kuò)增這兩個(gè)基因的完整編碼區(qū)。FAD3、FAD9的編碼區(qū)分別長1344bp、939bp。將

8、序列提交至GenBank中,登錄號為GU564350、GU564349。對FAD3、FAD9的DNA序列和氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。FAD3全長cDNA序列與蓖麻的此類基因相似性最高,達(dá)到83％,FAD9基因和蓖麻的delta9 desaturase相似性達(dá)84％。在線蛋白質(zhì)分析結(jié)果表明,FAD3蛋白質(zhì)分子量51660.6 Da,等電點(diǎn)8.25,屬于穩(wěn)定性蛋白。有七個(gè)可能性較大的跨膜區(qū)域,可能不存在信號肽的切割位點(diǎn),是一個(gè)非分泌性

9、蛋白,二級結(jié)構(gòu)中主要以α螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲為主,存在N-糖基化位點(diǎn)、依賴于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)等多種功能結(jié)構(gòu)域；存在Cyt-b5結(jié)構(gòu)域、FA_desaturase結(jié)構(gòu)域。與脂肪酸脫飽和酶功能相吻合。FAD9基因蛋白質(zhì)分子量36213.5Da,等電點(diǎn)8.62,屬于穩(wěn)定性蛋白。有五個(gè)可能性較大的跨膜區(qū)域,不存在信號肽的切割位點(diǎn),是一個(gè)非分泌性蛋白；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以α螺旋、無規(guī)卷曲為主；模體搜索顯示FAD9蛋白存在N-糖基