Ⅱ型豬圓環(huán)病毒ORF2、ORF3基因的克隆表達(dá)與潛在應(yīng)用研究.pdf

1、II型豬圓環(huán)病毒(Porcine corcirvims type II，PCV2)可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎腎炎綜合征、先天性震顫等多種疾病，臨床表現(xiàn)為生長遲緩、進(jìn)行性消瘦、呼吸困難、貧血、黃疸和腹瀉等癥狀，急性暴發(fā)豬群的死亡率可高達(dá)50％，對(duì)世界養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的危害。目前，尚無有效預(yù)防和治療措施，這與還沒有有效的疫苗以及病毒的基礎(chǔ)研究尚不清楚有關(guān)。本文對(duì)該病毒的衣殼蛋白(抗原蛋白)編碼基因orf2和新發(fā)現(xiàn)的orf3基因進(jìn)

2、行了克隆表達(dá)與應(yīng)用研究，以期為研究防治PCV2有效疫苗和PCV2致病機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。 本論文分別從山東省6個(gè)地區(qū)的6份陽性病料中PCR擴(kuò)增orf2基因和orf3基因。以orf2為靶基因進(jìn)行6個(gè)毒株的分子流行病學(xué)分析。序列同源性分析表明，6個(gè)毒株之間的核苷酸序列同源性為93.3～99.7％，氨基酸序列同源性為92.3～100％；氨基酸序列存在2個(gè)高變區(qū)，分別位于序列的57～90位和190～220位的區(qū)域，其中57～90區(qū)域位于結(jié)

3、構(gòu)蛋白的免疫反應(yīng)活性區(qū)；遺傳進(jìn)化分析顯示，SDI、SD III、SD V、SD VI與法國株(AY322000)和中國農(nóng)大株(EF524521)共同形成一群，可能起源于共同的祖先；SDⅡ、SDⅣ與其他7株P(guān)CV2毒株共同形成另一大群，與海南株(AY556476)的親緣關(guān)系最近；結(jié)合GenBank報(bào)道的山東境內(nèi)分離的13個(gè)PCV2毒株的orf2基因序列進(jìn)行RFLP分析，可將山東省PCV2流行毒株分為CHN-2H型、CHN-2F型、CHN-

4、2I型和兩種新的基因型，命名為CHN-2J型和CHN-2K型。其中，CHN-2H型所占比例最高，為優(yōu)勢基因型，是引起山東省規(guī)模化豬場暴發(fā)PCV2疾病的主要基因型，也與我國PCV2流行的優(yōu)勢基因型相一致，因此我們以此基因型為主研制防治PCV2的疫苗。 乳酸菌在食品發(fā)酵業(yè)具有悠久的應(yīng)用歷史，是公認(rèn)的安全(GRAS)細(xì)菌。以乳酸菌作為活疫苗載體，靶向表達(dá)醫(yī)用蛋白和抗原物質(zhì)，已成為醫(yī)藥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。為研制開發(fā)一種更為方便、安全、有

5、效的口服PCV2活疫苗，我們構(gòu)建了重組PCV2衣殼蛋白的乳球菌分泌型活疫苗載體，將去核定位信號(hào)的orf2基因(dCap)克隆入E.coli/L.lactis穿梭表達(dá)載體pSEC和pSEC：LEISS。SDS-PAGE和Western blot分析證明dCap蛋白在pSEC-dCap重組菌和pSEC：LEISS-dCap重組菌的菌體內(nèi)都得到誘導(dǎo)表達(dá)，而且pSEC：LEISS-dCap重組菌實(shí)現(xiàn)了蛋白的分泌表達(dá)。通過對(duì)誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)OD值、

6、nisin誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間四個(gè)因素的條件優(yōu)化，確定pSEC：LEISS-dCap重組菌最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件為：在OD600=1.0～1.2時(shí)加入終濃度為10～12ng/ml的nisin，18℃誘導(dǎo)6小時(shí)，分泌的dCap蛋白量可達(dá)1.2mg/L，比優(yōu)化前提高2倍。作為乳酸菌口服活疫苗制品，能否順利通過胃腸道環(huán)境并存活于腸道，同時(shí)將表達(dá)的抗原呈遞到免疫相關(guān)部位，是其能夠發(fā)揮功效的的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為了衡量構(gòu)建的重組乳球菌NZ9000/pSEC：L

7、EISS-dCap的疫苗應(yīng)用潛力，我們對(duì)其進(jìn)行了體外模擬胃腸道環(huán)境的耐受力檢測和小鼠活體免疫原性分析。結(jié)果表明，重組乳球菌對(duì)6％NaCl濃度的高鹽環(huán)境具有較強(qiáng)的耐受能力；可以耐受pH1.5-4.5的胃液環(huán)境；在人工腸液中出現(xiàn)較明顯的生長趨勢；但是對(duì)濃度為0.1％以上的膽酸鹽耐受力較差(體內(nèi)膽鹽濃度為0.03～0.3％)。因此，在作為口服活疫苗應(yīng)用時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)菌株進(jìn)行改造，提高菌株的耐膽鹽能力，以利于菌株在胃腸道環(huán)境中的生存和釋放抗原蛋

8、白。NZ9000/pSEC：LEISS-dCap重組菌培養(yǎng)液口服灌喂BALB/C小鼠對(duì)小鼠的生長發(fā)育沒有影響，無毒性作用；能夠誘發(fā)小鼠機(jī)體產(chǎn)生抗Cap蛋白的特異性抗體，血清中IgG含量較對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.02)，能夠刺激腸道粘膜淋巴組織對(duì)其產(chǎn)生粘膜免疫反應(yīng)。因此，作為疫苗制品具有很大的應(yīng)用和開發(fā)潛力。 ORF3蛋白是新發(fā)現(xiàn)的PCV2的非結(jié)構(gòu)蛋白，其功能目前尚不明確。為了對(duì)其功能進(jìn)行研究，我們分別從三個(gè)方面開展工作：首先

9、，采用PCR重疊延伸突變法對(duì)orf3基因進(jìn)行同義突變，結(jié)果使orf3基因的8個(gè)稀有密碼子替代轉(zhuǎn)化為E.coli偏愛的密碼子，以突變的orf3基因構(gòu)建E.coli表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了ORF3蛋白在E.coli中的高效表達(dá)，得到純化的ORF3蛋白。為下一步開展ORF3蛋白的性質(zhì)研究和制備ORF3蛋白抗血清做好準(zhǔn)備；其次，基于ORF3蛋白及其受體蛋白與p53蛋白(腫瘤抑制因子)密切相關(guān)的研究背景，開展了ORF3蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用研究，構(gòu)

10、建了pEGFP-ORF3真核熒光表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞HT 29和胃癌細(xì)胞SGC 7901，48小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞核形態(tài)均表現(xiàn)出明顯的凋亡特征，流式細(xì)胞儀檢測顯示細(xì)胞被阻滯在G0-G1期，LDH活性檢測細(xì)胞的死亡方式為凋亡，而非壞死。表明ORF3蛋白具有誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞HT29和胃癌細(xì)胞SGC 7901凋亡的作用，為下一步開展凋亡途徑和凋亡機(jī)制的研究打下基礎(chǔ)；最后，對(duì)ORF3蛋白介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)進(jìn)行研究。構(gòu)建真核表達(dá)載體pcD