豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)及亞單位疫苗的初步研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type2)不僅是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原，而且還與豬皮炎與腎病綜合征((PDNS)、豬先天性振顫(CT)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、豬增生性和壞死性肺炎(PNP)、母豬繁殖障礙等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。該病毒在世界各國(guó)蔓延，豬群的感染率非常高，主要侵害免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫機(jī)能下降，從而容易造成其它疾病的暴發(fā)。PCV2已成為當(dāng)前危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的病原之一，給

2、世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)自2000年檢測(cè)到PCV2后，該病毒在我國(guó)豬群的感染率一直呈上升趨勢(shì)，已嚴(yán)重影響了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。
　　 由于PCV2在細(xì)胞上的增殖滴度非常低，所以開發(fā)傳統(tǒng)滅活疫苗和弱毒疫苗難度很大，因此利用基因工程方法獲得安全、高效、廉價(jià)的新型疫苗成為PCV2疫苗研制的重要方向。ORF2基因編碼的Cap蛋白為PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白，Cap蛋白具有良好的免疫原性，ORF2基因是PCV2基因工程疫苗研究中的焦

3、點(diǎn)。本研究利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對(duì)PCV20RF2基因進(jìn)行表達(dá)，并在外源基因的5端引入Kozak序列，提高了Cap蛋白的表達(dá)量，為Cap蛋白作為PCV2亞單位疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 根據(jù)Genbank發(fā)表的PCV2基因序列(AY686764)，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，PCR擴(kuò)增PCV20RF2及其外側(cè)區(qū)域基因，測(cè)序結(jié)果與PCV2基因序列(AY686764)完全一致。根據(jù)測(cè)序結(jié)果針對(duì)ORF2基因設(shè)計(jì)三對(duì)引物，分別對(duì)ORF2基因進(jìn)

4、行PCR擴(kuò)增，并克隆到供體質(zhì)粒pFastBacI，構(gòu)建重組供體質(zhì)粒pFastBac-ORF2，然后轉(zhuǎn)化DH10Bac大腸桿菌，獲得重組桿粒，再轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞后傳代，獲得的重組桿狀病毒，分別命名為VBac.P22、VBac-KP22和VBac-KGP22，再分別感染sf9昆蟲細(xì)胞進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)。
　　 間接免疫熒光、SDS-PAGE和western blotting的鑒定結(jié)果表明：重組桿狀病毒VBac-P22、VBac-K

5、P22和VBac-KGP22均能在sf9昆蟲細(xì)胞中有效表達(dá)目的蛋白；小鼠ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果顯示：三種重組桿狀病毒表達(dá)的目的蛋白所制備的亞單位疫苗免疫小鼠，均能刺激小鼠產(chǎn)生特異性抗體，證明三種重組桿狀病毒表達(dá)的目的蛋白均具有良好的免疫原性；目的蛋白表達(dá)量的檢測(cè)結(jié)果顯示：三種重組病毒均以MOI=3感染相同培養(yǎng)條件下的sf9昆蟲細(xì)胞，通過(guò)Bandscan和紫外分光光度計(jì)測(cè)定，VBac-KP22的目的蛋白表達(dá)量為0.91mg/108cell