仙臺病毒N基因在昆蟲-桿狀病毒系統(tǒng)中的表達.pdf

1、仙臺病毒是人畜共患致病源之一。近年來，仙臺病毒對實驗動物和人的危害越來越為人們關(guān)注，檢測和預(yù)防仙臺病毒成為病毒研究者的重要任務(wù)之一。 利用病毒重要的抗原作為間接抗原診斷和免疫病毒宿主是預(yù)防病毒流行的重要方法。抗原多是病毒編碼的自身結(jié)構(gòu)蛋白，因此，本實驗依據(jù)仙臺病毒N基因抗原性與反應(yīng)原性的特點，對N基因進行克隆，構(gòu)建出昆蟲桿狀病毒N基因重組表達載體，表達出具有生物活性的重組蛋白，為檢測仙臺病毒和免疫動物提供基礎(chǔ)。 本研究先

2、在雞胚中傳代繁殖適量的仙臺病毒，提取純化后，以病毒基因組RNA做模版，經(jīng)RT-PCR擴增仙臺病毒N基因，將其克隆至pMD18-T中命名pMD18-T-N并測序。測序基因經(jīng)過PCR擴增被定向克隆至桿狀病毒穿梭載體pFastBac<'TM>HTb中，篩選正確重組質(zhì)粒命名pFastBac<'TM>HTb-N。測序鑒定后，pFastBac<'TM>HTb-N轉(zhuǎn)化入含桿狀病毒感受態(tài)細菌DH10BAC，通過Ecoli自身較低概率的同源重組，藍白斑篩

3、選插入目的片段的桿狀病毒，命名rBacmid-N。rBacmid-N經(jīng)過轉(zhuǎn)染生長狀態(tài)良好的昆蟲細胞，收毒接毒2-3代SDS-PAGE檢測蛋白表達條帶，表達的特異性條帶進行weston blot分析及與標準血清ELISA反應(yīng)，確定所表達的重組N蛋白生物活性。 測序結(jié)果顯示，得到約1.6kb的N基因，該基因與其它仙臺病毒株核酸序列相比有一定的無義突變，但序列編碼肽鏈高度同源；提取重組病毒DNA，經(jīng)PCR鑒定目的片段已經(jīng)插入桿狀病毒基

4、因組中。rBacmid-N轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細胞，昆蟲細胞病變明顯。SDS-PAGE電泳可見一條大小約60kD的特異性條帶，與預(yù)期一致。Western blot實驗結(jié)果顯示重組蛋白具有良好的抗原性。與標準血清ELISA反應(yīng)結(jié)果表明N基因有較好的反應(yīng)原性，適宜做間接抗原。 本實驗成功獲得仙臺病毒N基因，構(gòu)建了N基因昆蟲桿狀病毒N重組表達載體，并在昆蟲細胞中表達了有生物活性的重組N蛋白，為利用N作間接抗原診斷仙臺病毒及其作為免疫抗原奠定