桿狀病毒展示系統(tǒng)的構(gòu)建和表達(dá).pdf

1、將外源基因克隆在桿狀病毒的穿梭載體上，然后轉(zhuǎn)化E.coli DH10B感受態(tài)細(xì)胞并且提取質(zhì)粒，與含有Bacmid的感受態(tài)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)座，在含Kanr/Tetr/X-gal/IPTG的LB固體平板上挑取白色單菌落，提取大質(zhì)粒，在質(zhì)脂體的作用下感染Sf-21細(xì)胞，通過熒光顯微鏡的觀察可以知道基因的表達(dá)情況，此方法即是所說的Bac to Bac表達(dá)系統(tǒng)，同時(shí)此方法廣泛的應(yīng)用在病毒、真菌、植物和動(dòng)物的相關(guān)基因表達(dá)。其中武漢大學(xué)的劉鑫博士利用Bac

2、mid-egfp穿梭載體成功地表達(dá)了麻疹病毒受體SLAM，以綠色熒光作標(biāo)記發(fā)現(xiàn)表達(dá)的SLAM蛋白定位在Sf-9細(xì)胞表面，與人類細(xì)胞中的自然定位相同。而且Sf-9細(xì)胞表面的SIAM可以介導(dǎo)麻疹病毒對(duì)非受納昆蟲細(xì)胞的感染。證明該系統(tǒng)維持了親本Bac to Bac系統(tǒng)的特性和功能，但卻增加了親本Bacmid所不具我們利用兩個(gè)Bac to Bac系統(tǒng)，即基于AcMNPV的Bac to Bac系統(tǒng)(AcBacmid)和帶綠色熒光蛋白基因標(biāo)記的Ac

3、MNPV Bac to Bac系統(tǒng)(AcBacmid-egfp)，通過位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座，將AcMNPV多角體蛋白基因ph-ph和異源Mcherry和IRES基因轉(zhuǎn)座到兩個(gè)不同的Bacmid基因組中，再轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，構(gòu)建了三種重組穿梭載體：pFBDM-ph-ph，pFBDM-Mcherry和pFastBac1-IE2-red-IRES-egfp。 三種重組穿梭載體分別感染Sf-21細(xì)胞，4-5天后，其中將多角體蛋白基因和綠色熒光蛋白

4、基因的融合表達(dá)盒經(jīng)Bac to Bac系統(tǒng)轉(zhuǎn)座載體的位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座，轉(zhuǎn)到Bacmid基因組上，構(gòu)建成多角體蛋白與綠色熒光蛋白融合的重組穿梭載體Bac-ph-ph/gfp，將陽性的Bac-ph-ph/gfp DNA轉(zhuǎn)染Sf-21細(xì)胞后包裝成重組病毒vAc-ph-ph/gfp，ph-ph/EGFP融合蛋白能夠正常表達(dá)，在熒光顯微鏡下觀察可以發(fā)現(xiàn)綠色熒光及病毒包涵體，而且綠色熒光只在包涵體顆粒的表面產(chǎn)生，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核的其它地方?jīng)]有綠色熒光，

5、這說明綠色熒光蛋白通過與多角體蛋白融合能成功地展示到病毒包涵體的表面。同時(shí)與對(duì)照pFBDM-ph相比包涵體產(chǎn)生數(shù)量比較多，大小不均形狀也不規(guī)則。pFBDM-Mcherry和pFastBac1-IE2-red-IRES-egfp所感染的細(xì)胞不僅有綠色熒光而且有紅色熒光出現(xiàn)，表明了Mcherry和IRES基因在昆蟲細(xì)胞里表達(dá)。同時(shí)用pFBDM-ph-ph和pFBDM-Mcherry感染的上清液混合二次感染Sf-21細(xì)胞，紅色熒光融合在病毒包

6、涵體之中，表明異源的Mcherry蛋白能夠裝配到重組病毒pFBDM-ph-ph的ODV的囊膜上。 最后我們利用同源重組構(gòu)建的一種細(xì)胞壁合成缺陷型的大腸桿菌DHIOB-asd，asd是編碼二氨基庚二酸的基因，是細(xì)胞壁的重要組成。由于asd基因的缺失，所以必須在培養(yǎng)基中加DAP(二氨基庚二酸)細(xì)菌才能合成細(xì)胞壁，pGB2-inv質(zhì)粒含有inv基因，可以表達(dá)侵染蛋白。我們?cè)谶@里轉(zhuǎn)化pGB2-inv質(zhì)粒進(jìn)入大腸桿菌DH10B-asd-，

7、然后電轉(zhuǎn)pFBDM-ph-ph-AcBacmid-gfp進(jìn)入大腸桿菌DH10B-asd，構(gòu)建菌株DH10B-asd-inv-PFBDM-ph-ph-Acbacmid-egfp，我們將細(xì)菌菌液與昆蟲細(xì)胞Sf21直接混合。在inv侵染蛋白的介導(dǎo)下，大腸桿菌通過細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，在缺乏DAP的情況下，細(xì)菌不能合成細(xì)胞壁，裂解。pFBDM-ph-ph-AcBacmid-gfp釋放出來，復(fù)制、裝配、表達(dá)gfP綠色熒光蛋白，同時(shí)里